[发明专利]一种鉴别硬叶兜兰的核苷酸序列、分子探针和方法

说明书

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法鉴别硬叶兜兰的技术领域，涉及一种鉴别硬叶兜兰的核苷酸序列、分子探针和方法。

背景技术

硬叶兜兰（Paphiopedilum micranthum）是兰科（Orchidaceae）兜兰属（Paphiopedilum）的植物，主要分布于我国云南、广西、贵州等省区和越南北部。硬叶兜兰因花奇特，花姿优美具有较高的观赏价值，因而有“玉女兰”之称，被誉为世界最美的花朵之一。由于具有非常高的观赏价值和经济价值，人为过度采收和生境破坏严重，硬叶兜兰野生种群数量急剧下降，分布范围逐步缩小，野生资源处于极度濒危状态，被《濒危野生动植物物种国际贸易公约》列为一级保护植物。因此，为了有效保护和寻找新的硬叶兜兰群体，建立有效的鉴别硬叶兜兰的方法是十分重要的。

传统的形态学研究方法不能从本质上准确反映物种的遗传变异与材料间的遗传关系，单独利用传统的分类方法难以对种质资源的系统分类做出准确评价。随着生命科学的不断发展，分子标记鉴定技术应运而生，应用DNA 分子标记技术对植物进行鉴定取得了快速发展。DNA 分子标记技术弥补和克服了传统鉴别方法的一些缺陷和难题。本实验采用目标起始密码子多态（start codon targeted Polymorphism, SCoT）分子标记方法，对硬叶兜兰及其他一些兜兰种类的遗传多样性进行研究，获得了兜兰SCoT指纹图谱，从中筛选出硬叶兜兰特异性条带，通过克隆、测序等，设计了特异性探针，应用于硬叶兜兰的鉴定，为有效的鉴别和保护硬叶兜兰资源提供有效的分子技术依据。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种鉴别硬叶兜兰的核苷酸序列。

本发明用于鉴别硬叶兜兰的特征性核苷酸序列来源于SCoT通用引物2（5’-CAACAATGGCTACCACCC-3’）扩增所得的硬叶兜兰特异性核苷酸序列，具体序列为：

CAACAATGGCTACCACCCCTTAGCCTAAGGAGCTCTAAAGCTAGGGGAGGCTCCAGACTAGCGTTCCCCACGGTCGTATCACCGTGGAGACCGCCGGAGCCTCCCGGAAATGAAACCGAAAGAAAGAGCAGCCGGTGGTGGAGATAGAGGCTTACCCATGGTCCGTCAGTCAGATAAGAAGGTCCCTCGAGCTTCCTGGAGATGAGACGGAGCTAACGGCACCGGCCGGTGGTTGCAAGGTGGCCGGAGTTGACGTAGTCGACGGTGGTCAGTAACTTGTAAAGAGAGATTTCGGTATCATCGGGTATCCGTTTTTCACGATTTTTGATTCTATGTCCTCTTGAGGGGAAGGAGAATAACTTCCTAGGAGGAAGGTTGAGCTAAGGAGGGCTCTATGGATGACTTTGGAGGCTATCAATAGGGATTTTTTTTTGAGCTCGGAGAAGGATGGTAGCAGCGGATTTAGAGGGGCCTAGCAGGGCGCTCGGGTGGACGTTCCTCACAAATTTTGGCTCTATATTCTACTGAAGGGAAGGATAACAACTTATTAGAAGGAAGGTTGAGCTAATTAGGGCTCTATGGAGGACTTTGGAGGCTATCAATATAGGGATTCCTTGAGCTCAAAGGAGGGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别硬叶兜兰的核苷酸序列设计的用于鉴别硬叶兜兰的核苷酸分子探针（YYF/YYR），该核酸分子探针序列如下：

上游引物YYF：5’-GAAATGAAACCGAAAGAAAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物YYR：5’-AATGGCTACCACCCTCCT-3’，如SEQ ID NO.3所示。

上述核苷酸分子探针（YYF/YYR），具有极高的专一性，仅与硬叶兜兰发生反应，而不与其他兜兰种类反应。利用该探针通过常规PCR扩增可以快速的对硬叶兜兰进行鉴别。

本发明的第三个目的是提供上述鉴别硬叶兜兰的分子探针的方法。

本发明采用上述核酸分子探针（YYF/YYR）作为特异性扩增引物，以硬叶兜兰基因组DNA为模板，经PCR扩增，电泳检测，获得清晰的硬叶兜兰特异性条带，实现对硬叶兜兰的鉴别。

本发明具有的有益效果：

1)     样品用量少，只需少量样品就可以完成整个操作；