[发明专利]一种利用扩增DNA片段长度多态性测定短链RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种用扩增DNA片段长度多态性定量测定短链RNA的方法。 

背景技术

microRNA (即miRNA) 是一类调控基因表达的短单链小分子核糖核酸，由22个左右核苷酸（nt）组成。miRNA参与细胞的各种活动，影响并参与维持细胞的生理和分化状态，特定miRNA表达量的变化还能反映生物的生理、病理特征，预示其作为鉴定多种疾病的生物标记的可能性。例如肝细胞所特有的miR-122，在血液中的水平变化就可以揭示肝脏受损的情形。miR-122为肝脏细胞所独有，并在每个人类肝细胞中有13万个，具有目前用于肝损伤鉴定的生物标记物所欠缺的专一性及灵敏度。尽管miRNA在这些病变中所起的作用还有待明确，机制有待进一步的揭示，但这已成为目前miRNA研究的一个最重要的方向。其中miRNA定量检测方法的客观性、灵敏度及标准化是将miRNA研究成果推向临床疾病诊断应用的瓶颈和关键。 

已知人类拥有大约1千种以上的miRNA，与各种特定生理病理现象相关的miRNA表达量的动态范围很大，从个位数级别到上万，加上miRNA拥有超短的长度、相似的序列、二级构象、末端修饰及长度差异性等特性，给miRNA的纯化和准确定量带来很大的挑战。 

目前应用较多的对miRNA进行定量测定的主流技术包括定量反转录PCR（RT-qPCR）及同时测定多种miRNA的能力的miRNA深度测序法（miR-seq）和microArray杂交测定法等。其它也有很多基于RNA/DNA杂交技术的高通量技术平台，如NanoString nCounter、nanopore 技术，但受制于这些方法本身的不完善，缺乏应有的灵敏度和准确性，距离实际应用尚需时日。 

上述miRNA测定方法实际应用的主要问题是灵敏度，如其中最灵敏的NanoString nCounter法的测定低限为1 amol即约6x10⁵个分子以上的水平，而miR-seq和microArray的测定低限为0.1 fmol即6x10⁷个分子以上的水平，显然不满足大多数分子诊断的需求。 

其中miR-seq法，对miRNA的鉴定不依赖于miRNA序列，可以对miRNA新种的发现有不可替代的作用。而且其能统计出miRNA的相对读数，而有很多研究中利用它作了很多病理诊断应用方面的探索，发现了很多有益的苗头。但是，miR-seq的样品处理需要利用RNA Ligase、DNA Ligase制备适用的cDNA库，并经PCR扩增后才能上机检出，作到相对定量。冗长的样本制备过程及多种修饰酶的利用，破坏了待测目标数量与检测读值的线性相关性，影响miRNA测定的客观性。因此，如果没有更好的制备方法，miR-seq还不能作为miRNA定量测定的方法。 

反转录实时荧光PCR定量技术（RT-qPCR）是现代分子生物诊断方法中对RNA检出最灵敏、最客观可靠的方法，而且方法快捷，不需要特殊的设备。传统的RT-qPCR测定对象是长链的RNA，如mRNA，所用primers长度通常在20nt以上。但是，成熟miRNA的总长度才22nt左右,测定miRNA的RT-qPCR必须经过特殊的修饰，使之能适合qPCR。除茎环引物可作miRNA的RT以外，锁核苷酸引物(LNA)及多聚A聚合酶加尾-寡聚dT引发的RT也被应用于miRNA的定量测定。以利用TaqMan探针、茎环引物的反转录-qPCR方法为代表的实时荧光PCR定量法具备有测定单拷贝miRNA分子的能力，已经广泛的用于miRNA的机制研究、疾病诊断、治疗预后等的研究中。因其是所有方法中最灵敏、客观、容易应用，是验证从microArray、miR-seq方法获得的miRNA表达谱的优选方法。尽管不断的技术改进和对工艺的强化不断地催生新的miRNA qPCR检测方法，但是，至少有两大障碍阻止了这些技术在临床应用中的接受度：方法质量的评估及方法的标准化。这两个障碍严重影响到方法结果在不同批次、操作人员及实验室之间的重复性，即测定结果存在不一致不稳定的缺点。