[发明专利]一种酶解卵白蛋白的方法及酶解产物的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物酶解的技术领域，具体是一种酶解卵白蛋白的方法及酶解产物的应用。

背景技术

卵白蛋白是卵白中属于白蛋白部分的蛋白质。通常指的是其主要成分(约占卵白的65％)的卵清蛋白(Al bumi n)。除此外卵白中还存在着少量(约14％)的称为伴清蛋白(Conal bumin)的白蛋白，但是卵白蛋白在应用时不易直接被机体和皮肤吸收，必须将它水解成氨基酸和多肽才能被机体吸收。

现有技术中有很多方法将卵白蛋白酶解，例如采用酸或碱的方法来水解卵白蛋白，但是现有的这种方法往往会发生水解后氨基酸被全部或部分破坏，例如：用酸水解卵白蛋白时常造成丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸的部分破坏，色氨酸全部破坏，当用碱水解时可引起精氨酸及胱氨酸的部分及全部破坏，影响氨基酸的利用，无论用酸水解或碱水解都增加了分离纯化工作的难度并造成环境污染，本公司在93年时开发出了一种比较先进的酶解方法，具体见专利申请号为93112571.5，发明名称为“一种酶解保健液-酶解卵白蛋白溶液”的专利文件，但是，该专利公开的方法虽然解决的酸、碱酶解的缺陷，可是仍达不到酶解出最佳的小分子肽，为了更精确的获得小分子多肽，最大限度地使机体吸收，扩大受用人群，所以还需要开发出新的酶解方法。

发明内容

为了解决现有技术中酸、碱方法破坏卵白蛋白中氨基酸的技术缺陷、以及采用木瓜蛋白酶仍得不到最佳的小分子多肽的问题，本发明公开了一种新的酶解卵白蛋白的方法及酶解产物的应用，进一步改进了酶解方法，得到最佳的小分子多肽，并且发现了酶解产物新的用途。

实现上述目的，所采用的技术方案为，本发明公开的一种酶解卵白蛋白的方法，包括如下步骤，(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；

(2)对(1)步酶解后的混合物加热，去除未酶解的卵白蛋白残渣；

(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。木瓜乳汁中存在多种酶，主要含有四种半胱氨酸酶:木瓜蛋白酶、木瓜肽酶、木瓜凝乳蛋白酶A和B。除此之外，还含有溶菌酶，Ⅱ型几丁质酶和脂肪酶等，各种酶的氨基酸序列不同，其生化性质也有很大差别。本发明经过试验，最终采用木瓜肽酶将卵白蛋白酶解，将原先分子量约为37000-49000的卵白蛋白，酶解后最大限度的得到小分子的寡肽和氨基酸，不仅解决了用酸、碱酶解对氨基酸的破坏问题，与现有技术中采用木瓜蛋白酶对卵白蛋白进行酶解后对比，木瓜蛋白酶酶解产物中最小的分子量的肽为八肽物质，其分子量约为960左右，另外含有的肽分子量约为6×10⁴，本发明酶解产物中含有分子量约为500-1000的小分子寡肽和氨基酸酶解产物，8肽以下含量大于50％，其中5肽含量接近20％，由此可以看出，本发明酶解方法能够得到5肽的物质，并且最小分子量为500，所以采用该酶解产物可以进一步的促进人体皮肤或肠胃的吸收，并且经该方法得到的酶解产物还被验证了有新的用途。

进一步的，步骤(1)提取木瓜肽酶的方法为：①将木瓜粉溶解于0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中；

②向①步混合液中加入硫酸铵，使混合液的饱和度达到0.45，放置12-16h后抽滤，将上清液体用质量浓度0.1MNaCl溶液透析；

③将②步得到的透析液上柱CM Sepharose，用质量浓度为0.05－1.0MNaCl进行梯度洗脱，收集最后流出的液体；

④向③步得到的液体加入硫酸铵直至溶液饱和度达到0.85，放置12-16h后抽滤，将得到的沉淀用质量浓度0.05M NaCl溶液透析。将透析液冷冻干燥即可得到木瓜肽酶粉末。

木瓜肽酶的分离纯化不易操作，本发明选择该方法将木瓜肽酶提取出来，提取的纯度最高，操作方法最为简便。

优选的，步骤(2)中卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水的质量比为100:5-10:1-2.5:2000。所选择的质量配比在成本最低的条件下，酶解的最为充分。

优选的，步骤(2)中酶解温度为45-65℃，PH为6-7，酶解时间为12-24h，该参数条件正好可以使卵蛋白充分酶解为小分子多肽和氨基酸。

进一步的，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白残渣的具体方法为，酶解后将温度加热至90-100℃变性5-10分钟，使蛋白酶失活，将酶解产物过滤，得到上清液。