[发明专利]出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶及其重组表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶基因，还涉及表达苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体和应用。

背景技术

聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物，由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可作为药物载体与微胶囊材料、生物医学材料、吸水材料、化妆品、食品包装等材料，具有广泛的应用前景。

聚苹果酸主要由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)发酵生产，对聚苹果酸的生物合成途径研究表明，聚苹果酸是以TCA循环产生的苹果酸为底物进行合成。然而，迄今为止，以苹果酸为单体聚合生产聚苹果酸的聚合途径及相关基因尚未阐明。基于前期文献调研，聚苹果酸的聚合途径可能涉及两个酶即苹果酰辅酶A连接酶(malate-CoA ligase，Mcl)和聚苹果酸合成酶(polymalic acid synthase，Pas)参与反应，但是相关基因及序列在A.pullulans中未见报道，苹果酰辅酶A连接酶在ATP及辅酶A参与下，实现对单体苹果酸的酰基化，聚苹果酸合成酶催化聚合反应。微生物产生的聚酯型聚合物通常需要对单体酰基活化后，在聚合酶的催化作用下生产聚合物(Biomacromolecules,2012,13:2964-2972)。因此，单体酰基活化酶的底物特异性对于聚合单体的选择及新型共聚物材料的创制具有重要意义。本发明首次从真核生物出芽短梗霉中克隆得到苹果酰辅酶A连接酶基因，对实现出芽短梗霉代谢工程改造及提高聚苹果酸合成产率具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶；本发明的目的之二在于提供表达出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体中的应用；本发明的目的之四在于提供出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶，所述苹果酰辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，编码所述苹果酰辅酶A连接酶的cDNA如SEQ ID NO.9所示。

优选的，所述苹果酰辅酶A连接酶的基因组序列如SEQ ID NO.8。

2.表达所述出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.9所示序列连入pET32a(+)载体的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点而得。

3.所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化单体与辅酶A反应中的应用，所述单体为苹果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸中的应用。

优选的，出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在催化苹果酸与辅酶A生成苹果酰辅酶A中的应用。

4、所述的出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶在出芽短梗霉中提高聚苹果酸产量中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明首次从真核生物出芽短梗霉克隆了编码苹果酰辅酶A的基因组序列和cDNA序列，经比对发现，出芽短梗霉同褐螺菌属Phaeospirillum molischianum苹果酰辅酶A连接酶编码氨基酸同源性为51％，同红杆菌属Rhodobacter capsulatus苹果酰辅酶A连接酶氨基酸同源性49％，表明本发明克隆得到的苹果酰辅酶A连接酶为一种新酶蛋白，本发明还公开了将表达苹果酰辅酶A连接酶的重组载体，将苹果酰辅酶A连接酶重组表达后最适反应温度为25℃，但在20-40℃条件下均具有较好的催化活性；最适酶促反应pH为8.0，且在高浓度的ATP下对酶活性具有抑制作用，经苹果酰辅酶A连接酶单体选择性实验表明，出芽短梗霉来源的苹果酰辅酶A连接酶具有较宽的底物选择性，草酸、草酰乙酸、琥珀酸、柠檬酸、丁酸、丙二酸等均可作为该酶的催化底物。因此，本发明获得的苹果酰辅酶A连接酶可作为新型共聚物材料聚合的起始酶，开发新型高分子可降解材料。本发明还发现在出芽短梗霉中过表达出芽短梗霉苹果酰辅酶A连接酶能够提高聚苹果酸的产量，为通过代谢工程提高聚苹果酸的产量提供了有力工具。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：