[发明专利]一株快速发酵面包酵母菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株快速发酵面包酵母及其构建方法。

背景技术：

现今，面食花样繁多，制作方法也多种多样，但不管采取何种制作方法，面团的发酵过程都是整个工艺中的重要步骤，它直接影响着面食产品的质量。欧美等发达国家考虑到健康因素普遍以咸面包为主食，面包普遍为不加糖或低糖(加糖量低于6％)。我国人口众多，其中有一半左右的人口以面食为主，而且大都是馒头等不加糖面团发酵类面食，据统计北方约有70％的小麦面粉用来制作馒头。

面团发酵的实质是面粉在各种酶的作用下，将各种双糖和多糖转化为可发酵的单糖，再经酵母的发酵作用转化成二氧化碳，使面团膨胀和生成其它发酵物质，使面包增加风味、面团成熟的过程。面团发酵能力是衡量面包酵母产品质量的重要指标。良好的面团起发能力可以大大缩短面团发酵周期，从而提高经济效益。

在不加糖面团中，最主要的可发酵糖是麦芽糖。麦芽糖经麦芽糖通透酶运输到细胞内经麦芽糖酶水解为两个葡萄糖分子进入糖酵解途径，供细胞利用。6-磷酸葡萄糖是糖酵解过程的第一个中间物，在继续进行各种化学反应生成CO₂和H₂O、释放能量的同时，由葡萄糖磷酸变位酶(PGM2)转化成1-磷酸葡萄糖合成糖原，减少糖酵解途径的通量。因此，敲除葡萄糖磷酸变位酶编码基因PGM2，阻断6-磷酸葡萄糖到1-磷酸葡萄糖的转化，可以增加糖酵解途径的通量，提高有氧条件下CO₂的产量，从而提高面团发酵力。

SNR84基因编码H/ACA snoRNA(小核仁RNA)。大部分H/ACA小核仁RNA参与碱基修饰，像大亚基rRNA的假尿苷化，指定rRNA中假尿苷的形成位点；小部分H/ACA小核仁RNA在剪切前体rRNA中也起到重要作用。据推测，SNR84参与到激活大亚基rRNA假尿苷化的功能，加快大亚基rRNA的成熟速率和提高大亚基rRNA的数量。当成熟的大亚基rRNA在指数生长期快速形成时，大部分相关酶的产率提高。Lee等以半乳糖为碳源，通过过表达SNR84基因提高了酿酒酵母在半乳糖中的生长及酒精产量。

目前，很多研究通过对麦芽糖代谢途径直接相关基因的改造提高麦芽糖代谢速度，从而提高面团发酵力，对麦芽糖代谢途径间接相关基因的改造或对未知的麦芽糖代谢网络调节的报道较少，同时，目前对于H/ACA小核仁RNA的研究基本上集中在理论研究，关于H/ACA小核仁RNA的应用仅有少数报道，尤其在选育快速发酵菌株中的研究更是空白。因此，本发明通过完全敲除PGM2编码的葡萄糖磷酸变位酶基因，同时过表达SNR84基因编码的H/ACAsnoRNA，选育快速发酵面包酵母菌株，满足酵母应用相关领域对酵母的较高要求。

发明内容：

本发明所解决的技术问题之一是提供一株快速发酵面包酵母菌株。

所述快速发酵面包酵母菌株是在出发酵母菌株中完全敲除PGM2编码的葡萄糖磷酸变位酶，同时过表达由SNR84基因编码的H/ACA小核仁RNA全序列所得。

所述PGM2基因其Gene ID为：855131，序列如核苷酸序列表中SEQ NO:1所示；所述SNR84基因其Gene ID为：9164879，序列如核苷酸序列表中SEQ NO:2所示。

优选的，所述出发酵母菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。

本发明所解决的另一个技术问题是提供一种快速发酵面包酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)PGM2基因的敲除

①以质粒pUC6为模板，PCR扩增KanMX基因；

②将步骤(1)-①得到的PCR产物导入出发酵母菌株中，获得KanMX替代敲除PGM2的重组菌株1；

③用pGAP质粒去除步骤(1)-②获得菌株中的KanMX基因，获得完全敲除PGM2的重组菌株2；

(2)SNR84基因的过表达

①以面包酵母CICC31616总DNA为模板，PCR扩增SNR84基因；

②将步骤(2)-①得到的PCR产物连接到含有PGK1强启动子的质粒上，获得表达质粒1；

③以表达质粒1为模板，通过PCR扩增获得SNR84基因和强启动子的连接片段；

④将步骤(2)-③获得的片段连接到带有KanMX抗性的载体上，得到表达质粒2；