[发明专利]一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。

背景技术

表观遗传学是在研究与经典孟德尔遗传法则不相符的生命现象过程中逐步发展起来的一门学科，又称为“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”或“后遗传学”，主要研究在细胞核中脱氧核糖核酸（DNA）没有改变的情况下对于功能可逆的、可遗传的改变。甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。DNA的甲基化是表观遗传学的一种机制，它通过特定的甲基化酶将甲基加在DNA分子上，如胞嘧啶的5’碳上，甲基化之后的DNA序列在复制、转录及翻译的过程中都不会发生改变，但是却会改变最终的遗传表现。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）和少量的6-甲基氨基嘌呤（N⁶-甲基腺嘌呤，m⁶A）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。甲基化修饰同样也会发生在RNA水平上。

RNA同时具有调控和信息分子的双重功能，在众多细胞机制中发挥着核心的作用，例如作为遗传信息的信使，催化生化反应，作为细胞结构骨架等。RNA转录后的修饰为RNA功能的多样化奠定了化学基础， 2011 年更新的RNA修饰数据库RNAMDB共收录了109 种RNA的修饰形式，其中甲基化修饰占80%，最常见的是发生在信使RNA（mRNA）中腺苷的N⁶位置上（m⁶A），但被研究得不是很多。

6-甲基氨基嘌呤是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化，最早是在细菌DNA中发现的。1955年Dunn等人在观察胸腺嘧啶的结构类似物对Bacterium coli 15T的影响时，发现DNA复制过程中出现了一种新碱基。将DNA水解后利用二维纸层析方法进行碱基分离时，除了得到四种常见的碱基（A、T、C、G）外，还发现了第五个紫外吸收点。经过多重实验鉴定，对应于该吸收光点的新碱基为N⁶-甲基腺嘌呤。同时，在其他一些菌株和噬菌体中也检测到了6-甲基氨基嘌呤的微量存在。1958年，Dunn等人在研究Bacterium coli RNA中的非自然碱基时也同样分离到了6-甲基氨基嘌呤。另外，在多种高等真核真核生物以及病毒的mRNA中都检测到m⁶A的存在。6-甲基氨基嘌呤如此广泛的存在让我们很难忽视它的生物学意义和重要性，从而进行更深入的研究。

传统认识认为，由于被甲基化的碱基A没有改变它的碱基配对能力，目前还不能通过直接测序来检测，也没有发现它有独特的的化学反应。如DNA中的5-甲基胞嘧啶经过亚硫酸氢盐法处理后会发生碱基变化从而可以通过测序检测。所以之前的检测方法一直是基于放射性标记技术，即将甲基供体S-腺苷甲硫氨酸进行放射性标记，并于待处理的细胞进行孵育，随后通过薄层色谱（TLC）或高效液相色谱（HPLC）来检测。但是这种方法既昂贵又繁琐，效率又低，而且无法实现大规模的基因检测及确切的甲基化位点的定位，局限性很大。因此，发展新型的甲基化碱基A的检测方法，方便、快捷、低成本地对其进行检测，十分重要。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种方便、低成本的定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。

本发明基于引物延伸法和凝胶电泳法的原理对DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤进行检测，其检测原理是：含有6-甲基氨基嘌呤的模板链在延伸时会降低底物的活性，使延伸减慢；同时在含有甲基化的位点与模板链互补配对的互补链不能发生延伸；通过反应时间的不同，可以区分甲基化和非甲基化的序列，同时也可以对特定位点的甲基化水平进行定量评估。