[发明专利]一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体及其制备方法

权利要求书

1.一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其是通过将牛乳铁蛋白肽基因接入pYES2质粒中，并用磷酸丙糖异构酶（TPI）启动子替代pYES2质粒的GAL1启动子所得。

2.根据权利要求1所述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）PCR扩增TPI启动子序列；

（2）PCR扩增不含GAL1启动子的pYES2质粒序列；

（3）将上述两个片段进行平末端连接，得到重组表达载体；

（4）将牛乳铁蛋白肽基因序列插入到步骤（3）所得到的重组表达载体中，即得到pYES2 -TPI –LfcinB重组质粒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）的操作为：以含有TPI启动子序列的pYX212质粒为模板，利用引物TP1：5’-TCTTCAAGAATTGGGGA -3’和TP2: 5’-CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’进行PCR扩增。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）的操作为：以pYES2质粒为模板，设计引物：Y1：5’-CCGGATCGGACTACTAGC-3’和Y2:：5’-ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’进行反向PCR以删除pYES2质粒中的GAL1启动子。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）的操作为：将TPI启动子PCR产物和缺失启动子pYES2质粒PCR产物按2：1混合，用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化后，再用T4 DNA连接酶连接。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）的操作为：将步骤（3）得到的重组表达载体和牛乳铁蛋白肽基因序列用EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切4h，并做粘性末端连接，即得到pYES2 -TPI –LfcinB重组质粒。

9.一种牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株，其是由权利要求1～8任一项所述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体转化酿酒酵母INVSC1菌株所得。

10.一种牛乳铁蛋白肽的生产方法，包括对权利要求9所述的牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株进行诱导培养，从而得到牛乳铁蛋白肽。