[发明专利]一种固液结合制备比伐卢定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备比伐卢定的方法。

技术背景

比伐卢定（Bivalirudin)，商品名Angiomax，由美国Medicines公司申请，2000年12月经FDA批准首先在美国上市。作为抗凝药用于治疗接受经皮冠状动脉腔内成型术（PTCA）的不稳定型心绞痛患者。比伐卢定是水蛭素类似物，根据水蛭素蛋白序列设计，化学合成。与水蛭素相比，其作为凝血酶抑制剂具有直接性、特异性、可逆性等优点。

比伐卢定是一个有20个氨基酸组成的多肽，氨基酸序列如下所示：D-¹Phe-Pro-Arg-Pro-⁵Gly-Gly-Gly-Gly-⁹Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-¹⁵Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-²⁰Leu-OH。

关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。中国专利CN101475631A、CN102164609A、CN102264757A采用液相合成方法，由于比伐卢定含有20个氨基酸残基，肽序较长，液相反应较为繁琐，不易纯化，合成起来花费时间较长，收率低。

比伐卢定结构中含有-Gly-Gly-Gly-Gly-片段，采用固相逐步接肽合成时，由于Gly自身的特性，在合成中会极易产生Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的杂质肽，而且这些杂质在后续分离中很难去除；针对上述难题，专利WO2010117725采用Fmoc-Gly-Gly-OH作为单体合成比伐卢定，很好的避免了杂质Bivalirudin±1Gly的生成，但仍然无法避免Bivalirudin±2Gly的产生；CN102260323A提出先在液相条件下合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH四肽片段，然后将其接到肽树脂上，再逐步接上剩余氨基酸，可有效避免上述四个杂质的产生。专利CN102286076A和CN102532274A，其中也是在液相条件下合成两肽、三肽或四肽等片段肽，将其接到肽树脂上，其目的也是尽量避免上述杂质肽的生成。

同时比伐卢定的合成过程中，发现Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的溶解性较差，即使在DMF中也很难完全溶解，给接肽反应带来困难；专利CN103242431A采取先液相合成片段5肽Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，然后再固相接到肽树脂上，片段5肽在DMF中的溶解性远远好于Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，为片段肽的纯化及后续的接肽反应，降低了难度。

在比伐卢定的工艺开发中，3位Arg的连接比较困难，难以避免产生缺失Arg的杂质或是此位点由于偶联不完全而封端的杂质肽，即使复投两次也难以达到反应终点；专利CN102532274A采用Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH作为单体，解决了这个问题；但其采用Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH作为单体接肽，仍然会后遇到溶解困难，单体难以纯化的问题。

发明内容

为了解决以上比伐卢定合成中遇到的难点，本发明提供一种固液结合制备比伐卢定的方法，既能避免杂质Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的产生，又能解决3位Arg的偶联困难，需要多次复投的难题；同时提高粗肽的纯度，降低纯化难度，使生产成本进一步降低，利于工业上大规模生产比伐卢定。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体，用Fmoc-Leu-OH与之偶联反应制备Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂，再按序列依次偶联连接11个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护比伐卢定[9-20]肽树脂；

比伐卢定[9-20]肽树脂的结构如下：

Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)- Leu-树脂；

    （b）在液相条件下由双甘肽和Boc-Pro-OH或Fmoc-Pro-OH为原料制备Pro-Gly--Gly -Gly--Gly-OH，然后再用Fmoc-Arg(pbf)-OH与之反应得到片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly-Gly-OH；