[发明专利]一种固液结合制备比伐卢定的方法

权利要求书

1.一种固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）采用Wang树脂或2-chlorotrityl树脂为固相载体，用Fmoc-Leu-OH与之偶联反应制备Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂，脱保护试剂脱掉保护基Fmoc后，再按序列依次偶联连接11个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护的比伐卢定[9-20]肽树脂；

比伐卢定[9-20]肽树脂的结构如下：

Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)- Leu-树脂；

    （b）在液相条件下由双甘肽和Boc-Pro-OH为原料制备Pro-Gly--Gly -Gly--Gly-OH，然后再用Fmoc-Arg(pbf)-OH与之反应得到片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly-Gly-OH；

（c）比伐卢定[9-20]肽树脂脱Fmoc后和片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly- Gly-OH在固相条件下缩合反应生成18肽片段肽保护树脂，再按序列依次连接上Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH或Fmoc-D-Phe-OH，完成比伐卢定肽树脂的制备，经裂解、纯化、冷冻干燥得比伐卢定精肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，所述制备的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度为0.3-1.5mmol/g；

所述脱保护试剂为体积比20%哌啶的DMF溶液；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，所述制备的Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度为0.4-0.8mmol/g。

4.根据权利要求1所述的固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于步骤（c）中具体操作步骤为：

（1）将所述比伐卢定[9-20]肽树脂用脱保护试剂脱除Fmoc后，再加入Fmoc-Arg(pbf)-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-OH的活化溶液发生偶联反应，制得侧链全保护的比伐卢定[3-20]肽树脂：

Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ile-Pro- Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；

（2）将上述比伐卢定[3-20]肽树脂用脱保护试剂脱除Fmoc后，再依次与Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH发生偶联反应，制得比伐卢定肽树脂；

（3）所得比伐卢定肽树脂经裂解试剂处理后，滤得裂解液，经沉降、分离得比伐卢定粗肽；所得粗肽经制备液相纯化后得的精肽溶液，浓缩冻干后得比伐卢定精肽。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述脱保护试剂为体积比20%哌啶的DMF溶液；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；所述裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的固液结合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤（b）中，所述片段六肽Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH制备方法为：

将Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中，加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，加入稀盐酸调溶液pH值至2～3，析出固体，抽滤得白色固体，水洗3遍，干燥后重结晶，即得。