[发明专利]一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺

说明书

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸生物转化的方法，特别是涉及利用乳酸菌的活性静息细胞作为转化反应的酶源。 

背景技术

GABA在人体中是一种重要的抑制性神经递质，在脑内，GABA以突触后抑制为主，在脊髓中，GABA以突触前抑制为主，减少谷氨酸的释放，L-谷氨酸作为兴奋性神经递质，传递神经冲动，通过突触前抑制作用可以减少神经冲动的传递。如果人体内兴奋和抑制的平衡失控，将会导致许多神经紊乱相关的临床疾病。因此，GABA在人体内具有极其重要的生理功能，健脑益智，抗击癫痫，还能美容皮肤，延缓脑衰老，同时还具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压、利尿、改善老年痴呆症和帕金森症等神经衰败症等的作用，还能降低血氨，解除氨毒，促进乙醇代谢。作为抑制剂，它还具有抑制癌细胞的增殖的作用。最近的一项研究表明，γ-氨基丁酸能够促进胰腺分泌胰岛素，并有效地防止糖尿病的发生。 

GABA的制备方法主要有植物富集法、化学合成法和生物合成法三种。植物富集法操作复杂，且得率低，不适于规模化生产。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能被认为是一种天然食品添加剂。生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。 

生物法合成GABA是利用生物所含谷氨酸脱羧酶，将L-谷氨酸或其钠盐经α-脱羧生成GABA的过程，再分离纯化得到GABA制品的方法。谷氨酸脱羧酶存在于多种细菌、古细菌和真菌中。乳酸菌是被人们普遍接受且安全的、对人体友好、有益的菌株，已经被广泛应用到食品发酵生产中。利用乳酸菌发酵生产GABA是一种环保有效的生物合成方法。 

国内外对乳酸菌发酵生产GABA的研究主要是高产菌株的筛选及传统发酵方法的优化。但研究表明乳酸菌的生长与发酵转化产GABA所需的pH值并不一致，传统发酵方法为了保证发酵菌体的良好生长，同时兼顾GABA的高效转化，通常采用2步法控制发酵培养基的pH，首先保持菌体的最佳生长pH，待菌体生长到一定浓度后将pH条件为发酵转化的最佳值。同时传统发酵方法时间较长，需防止杂菌污染，且产物杂质较多。由此可以看出，传统发酵方法生产GABA操作复杂，产物分离困难，阻碍了工业化生产的进一步发展，需在发酵方式上进行改进，以简化发酵生产的条件控制及减少产物中杂质，以利于产物的分离纯化，从而降低生产成本，提高转化效率。 

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种利用乳酸菌转化生产GABA的新方法，将细胞培养与GABA转化过程彻底分开，简化控制条件控制，且能将每个部分的作用最大化，从而提高转化的综合效率。 

本发明提出的一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺，步骤如下： 

（1）将斜面上的GABA高产乳酸菌种接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有2%-4%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于30-40℃下静置培养20-40h。

（2）12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。 

（3）将所获得静息细胞均匀分散于转化缓冲液中，静息细胞的浓度为OD₆₀₀为1.0-8.0，pH控制在3.0-6.0，温度控制在25-35℃，缓冲液中引入了乙醇，浓度控制在0.5-2%，转速50-150rmp；转化时间3-5h获得GABA。 

本发明所述的菌株是GABA高产乳酸菌株，包括短乳杆菌、肠球菌、戊糖片球菌等多种类群乳酸菌菌株。 

本发明中在菌体培养阶段需要添加谷氨酸脱羧酶的诱导剂MSG，因该酶为诱导酶，只有经过诱导培养获得的静息细胞体才有GABA转化的活性。 

本发明中采用改良的MRS培养基培养菌体，在合适的pH值下，菌体能够快速生长，能够在较短时间内获得大量菌体。 

本发明中在转化缓冲液中引入乙醇，在0.5-2%的浓度下能大幅提高静息细胞转化产GABA的效率。 

作为优选，所述的改良MRS各成份的质量浓度分别为蛋白胨(5 g/L)、牛肉膏(5 g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、柠檬酸二胺(1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、碳酸钙20 g/L。pH为6.5-7.5。 

作为优选，所述的柠檬酸缓冲液浓度为0.2M。