[发明专利]RCA报告探针及其用于检测核酸分子的用途

说明书

技术领域

本发明涉及样品中的分析物的检测，具体地涉及样品中的核酸分子(例如核酸分析物)的检测，所述分析物可以是待检测的分析物或可指示分析物在样品中的存在(即所述分析物的标志物或替代物)。本发明涉及用于滚环扩增(RCA)测定(也称为滚环复制(RCR)测定)的新的核酸检测探针(核酸构建体)的提供。本发明还提供了将所述探针用于检测分析物例如靶核酸分子(即核酸分析物)的方法。

本发明的检测探针被设计来提供足以启动(即直接使得能够进行)RCA(RCR)反应(即无需向测定中添加另外的核酸组分以产生RCA产物)的核酸组分(即底物)。在探针已被切割和/或解折叠之前，由探针提供的RCA组分不可用于RCA反应，即RCA反应的组分的至少一种必须在RCA反应可发生之前，通过解折叠探针和/或切割探针来释放。与靶核酸分子相互作用的被切割的和/或解折叠的探针将产生RCA产物，特别地被局限于靶核酸分子的RCA产物。被切割的和/或解折叠的探针被延伸(即探针的域被延伸)并且延伸产物的检测发出靶核酸分子存在于样品中的信号。因此，本发明的探针具有减少添加至测定以实现滚环扩增反应的不同起始核酸组分的数目的作用，即减小存在于检测测定中的起始组分的复杂度，同时保持与RCA测定相关的有利方面。在测定中减小初始组分的复杂度的可观察到的作用是本底信号，即来自测定的组分之间的非特异性相互作用的信号的减弱，从而提高测定的特异性和灵敏度。

背景技术

滚环复制(RCR)反应在本领域中已被详尽描述，并且已被证明在多种用于检测样品中的靶核酸分子，即用于靶核酸分子的复制或扩增的测定(其中检测所述复制或扩增的核酸分子)中是有用的。因此，滚环复制(RCR)通常被称为滚环扩增(RCA)，并且这些术语在本文中可互换使用。已开发了其中通过超支化或DNA级联反应(如WO 97/19193和WO 97/20948中描述的)进一步扩增滚环产物的RCA法。然而，在本申请中，无意将RCA限定于需要超支化或DNA级联反应的反应。

RCA涉及使用环状单链核酸分子例如环状寡核苷酸作为滚环模板(RCA模板)，并使用链置换聚合酶延伸与所述模板杂交的引物进行的核酸分子的合成。在某些典型测定中可由靶RNA分子或靶DNA分子提供引物。聚合酶和核苷酸的添加启动合成反应，即聚合。由于滚环模板是无尽的，因此所得的产物是由与滚环模板互补的串联重复组成的长单链核酸分子。

实际上，RCA反应通常利用线性核酸分子，例如寡核苷酸诸如在下文中更详细描述的锁式探针，通常通过例如使用连接酶将所述核酸分子的末端连接在一起来操纵所述核酸分子以产生环状核酸分子。例如，可通过它们与用作连接模板的靶核酸分子上的相邻序列杂交来将核酸分子的末端彼此接近。环状核酸分子的形成使得其在RCA反应中能够被拷贝。该反应可通过向封闭环添加引物来引发，或可从靶核酸分子即连接模板产生引物。所述RCA产物从而形成初始引物的部分。这可以是特别有利的，因为其可允许对靶核酸进行局部检测，即在其中固定用于引发RCA的核酸分子的实施方案中，所述RCA产物也将被固定。

因此，RCA产物可保留作为核酸环的一串串联重复互补拷贝，其对于原位检测是特别有用的，但可在均相(“溶液中”)测定中被检测到。例如，RCA反应可在仅1小时内导致环的1000倍扩增(基于由约100个核苷酸组成的环)。因此，环状寡核苷酸的RCA可产生形成直径可为约1μm的DNA束或“串滴(blob)”的RCA产物。所述产物可通过缀合于荧光标记的核酸探针(检测探针)的杂交来检测，即串滴DNA，所述杂交允许通过荧光显微镜术(在非均相测定中，即原位)或流式细胞术(在均相测定中)使串滴可视化。在其它实施方案中，可通过用限制性内切酶或核酶进行消化(例如WO 98/38300和Dahl F等人Proc Natl Acad Sci U S A.101(13),4548-53(2004))来将RCA产物还原成单体，随后检测所述单体。

RCA可用于检测样品中的任何核酸分子的报告系统并且通常已被用于直接检测细胞和组织样品中的靶核酸，例如核酸分子的原位(即局部)检测，这对于研究和诊断目的具有重大意义。然而，RCA测定不限于用于非均相形式，而且还可用于均相测定(参见例如WO 2009/037659)。