[发明专利]邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及ELISA酶联免疫检测技术领域。更具体地，涉及一种邻苯二甲酸酯类总量ELISA酶联免疫检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯（phthalate acid esters，PAEs）类化合物又称为肽酸酯，邻苯二甲酸酯的一般化学结构是由一个刚性平面芳烃和两个可塑的非线性脂肪侧链组成，常温下呈无色油状粘稠液体，难溶于水且不易挥发，凝固点低，易溶于甲醇、乙醇、乙醚等有机溶剂，主要应用于塑料制品，用来提高可塑性和韧性，还用作农药、染料、化妆品、香料和医疗器材的生产原料。PAEs与塑料分子以氢键或范德华力连接，并非以共价键形式牢固结合，因此很容易通过淋洗迁移或蒸发等方式进入室内空气、大气、食品、饮用水及其他物质中，也可以在塑料生产或燃烧过程中通过烟尘沉降释放到环境中。过去一直认为PAEs的毒性很低，因而毫无限制地生产。但后来研究表明，它具有种类多、难以降解、生物富集性强的特点，对人体、生物体及植物均有较大的毒性。研究发现多种PAEs都具有一般毒性和特殊毒性，部分PAEs对动物有致畸和致突变的作用，并显示出较强的内分泌干扰性。邻苯二甲酸酯类污染物对人类的危害主要表现在致癌性、致畸性以及免疫抑制性，尤以造成人体生殖功能异常最为引人注目。PAEs类化合物伴随着烟尘、废弃物、工业和生活垃圾、废水等大量地进入我们生存的环境中，威胁着人类的健康，从而引起越来越多人的关注。

由于人类社会的大量生产和广泛使用，邻苯二甲酸酯已成为地球上最广泛存在的环境污染物之一，PAEs引起的环境污染已受到全球性关注，邻苯二甲酸酯类化合物被人们称为“第二个全球性PCB污染物”，1977年美国国家环保局（EPA）将DEHP、DOP、BBP、DBP、DEP和DMP这6种PAEs化合物列为优先控制的有毒污染物，我国也将DEP、DMP和DOP这3种PAEs化合物确定为环境优先控制污染物。食品中邻苯二甲酸酯的测定的国家标准GB/T 21911-2008中规定含油脂样品中各邻苯二甲酸酯化合物的检出限为1.5mg/kg，不含油脂样品中各邻苯二甲酸酯化合物的检出限为0.05mg/kg。2011年5月，台湾发生全球首例塑化剂污染案，一些食品及饮料制品中检出大量DEHP，经研究发现，食品添加剂生产商将DEHP添加到食品性乳化剂中，以提高食品均匀度。于2012年爆出的白酒塑化剂风波更加重了人们对塑化剂的恐惧。

目前，PAEs的分析多采用仪器分析法，液相-质谱联用，气相-质谱联用，关皓月（中国新药杂志，2013）等人用气质联用色谱法测定明胶空心胶囊中的邻苯二甲酸酯类化合物，杨荣静（环境化学，2012）等人用高效液相色谱-串联质谱法检测食品接触材料中17种邻苯二甲酸酯类增塑剂。仪器分析方法可以实现多残留检测，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，通常是作为实验室的确证方法。

酶联免疫分析（ELISA）快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，值得我们推广成为常用的筛选方法。ELISA免疫分析方法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

但是免疫分析方法多为单一酯类的检测，由于邻苯二甲酸酯种类繁多，且多个化合物同时被检测出来的现象十分普遍，但是同时检测所用的方法都为仪器分析法，因此，非常有必要建立可同时检测多个PAEs的多残留检测方法（multi-residues analysis）。目前国内外未有商品化的邻苯二甲酸酯ELISA检测试剂盒，有关邻苯二甲酸酯免疫分析技术（IA）的报道也极少，目前国内外主要集中在针对单一邻苯二甲酸酯建立特异性免疫检测方法研究，尚无检测邻苯二甲酸酯类总量的全抗原设计与抗体制备的相关研究。