[发明专利]一种食品及饲料中鸡源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，食品及饲料中鸡源性成分的PCR核酸扩增，及侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。

背景技术

为防止牛海绵状脑病( bovine spongiform encephalopathy, BSE )经添加在动物饲料中的牛肉、牛骨传播，1994年欧盟和1997年美国分别在1994年和1997年制定禁止在反刍动物的饲料中添加反刍动物源性蛋白的法规，2000年欧盟将这项禁令扩大到禁止向用于食用的动物饲喂加工过的哺乳动物、鸟类和鱼类蛋白成分。我国农业部于2004年颁布的《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》中规定禁止在反刍动物饲料中使用动物源性饲料产品(乳及乳制品除外)，但在动物饲料中人为掺入反刍动物（主要是牛、羊）肉和骨制品的现象时有发生。

近年来，国内外食品市场上假羊肉、假牛肉等以假乱真现象层出不穷，动物源性食品掺杂掺假等各种食品安全事件的频发越来越让老百姓心惊胆颤。2013年初，欧洲的“马肉风波”愈演愈烈，使得消费者“闻马色变”。之后欧美的”鱼肉风波”又再一次拉响了食品安全的警钟。要保证食品及饲料的安全，需要灵敏、便捷、准确的检测方法提供基础。

传统的食品及饲料中动物性成分鉴定主要通过显微镜检、基于蛋白质检测的免疫学方法以及基于核酸检测的各类PCR方法，近年还发展了近红外检测法(NIRS)。食品及饲料成分中掺入的各种动物源成分在高温处理和加工过程中易于受到破坏，不同种属动物的蛋白质序列之间差异不大，难以区别，发明专利“SDS-PAGE 法鉴别肉及肉制品中动物源性成份”（公开号：CN 102213720 A）提供了一种以蛋白质的SDS-PAGE电泳方式鉴定猪、牛、羊、鸡、鱼的动物蛋白的方法，但不同来源和处理方式的蛋白电泳谱带不同，带来结果判别的障碍，对于饲料中的动物成分更难以实施。

因为基因编码序列的简并性特征和非编码序列的存在，核酸成为较蛋白更易检出差异的靶分子，特别是线粒体DNA，拷贝数高，存在物种间差异，对其差异片段的分析是主要的鉴定方法，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR方法及基因芯片技术。在以线粒体DNA序列进行物种的种属鉴别时，常用的区域包括编码细胞色素B的Cytochrome b基因（cytB）、核糖体小亚基12S RNA编码序列（12S ribosomal RNA）、细胞色素C亚基I（cytochrome C oxidase subunit I）的编码基因coxI、编码ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制区D-loop片段。这些区域的序列变异适中，即在种内有一定的保守性，又体现出一定的种间差异。

荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。 在物种鉴定应用方面，国内已经发布的国家标准或行业标准涵盖了鸡、羊、鹿、骆驼、马、驴、猪、兔、狗和鱼等哺乳动物或水生生物。鉴于反刍动物的重要性，发明专利“鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR 检测试剂及制备方法和应用”（公开号：CN 101659996A）描述了一种能同时鉴别牛、羊和山羊的荧光PCR方法，以三条探针进行动物来源甄别。“一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法（公开号: CN102864243）”在检测中以转化生长因子（transforming growth factor）基因为靶点，增加了一个质粒DNA作为内标以减少假阴性的风险；公开号为CN101196463的发明专利“一种动物源性成分的鉴别方法”提供了一组可以鉴别牛、羊、猪、马、鸡等脊椎动物的引物序列和常规PCR-凝胶电泳方法。类似地，公开号为CN 101270392A的发明专利“PCR -mtDNA 检测总禽源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法”则进一步提供了以一对引物检测多种禽类来源线粒体DNA的方法，上述方法中，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。