[发明专利]甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法及应用。 

背景技术

利用杂种优势提高产量是国内外油菜生产的重要目标和发展方向。油菜杂种优势利用途径有细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、自交不亲和、化学杀雄等方法。细胞质雄性不育是当前应用最广泛的油菜杂种优势利用途径，尽管它存在保持系和恢复系的选育周期长、有潜在的细胞质负效应等缺点。我国主要是波里马细胞质雄性不育，其育成的杂交种占领我们油菜种植面积的60%左右；国外主要是萝卜细胞质雄性不育，除了德国NPZ种子公司及其股份占有公司利用MSL系统（具体内容属于该公司机密）、加拿大Bayer公司利用其具有自主知识产权的转基因细胞核雄性不育系统选育杂交种外，其他公司基本上都是利用萝卜细胞质雄性不育选育杂交种。 

我们在研制出一种大量繁殖自交不亲和系的方法（专利号：ZL200810236719.X）的基础上，将自交不亲和三系（自交不亲和系、保持系、恢复系）杂种选育方法（傅廷栋主编，1995）简化为“两系”（是指自交不亲和系、恢复系）杂种选育方法（专利号：ZL200810236960.2）。与波里马细胞质雄性不育和萝卜细胞质雄性不育相比，自交不亲和两系杂交种选育方法具有育种程序简单、杂交种选育周期短、杂种优势强、亲本繁育程序简便、良种生产成本低等优势。 

自交不亲和表型鉴别在两系杂种选育中起很重要的作用。通常用田间亲和指数法来进行判别，即在田间通过套袋自交结籽情况计算亲和指数（Self-compatibility Index,简写为SCI，亲和指数=籽粒数/花朵数），不仅费时因而效率低下、受时间限制（必须在油菜开花后进行），而且结果还易受环境影响。我们利用候选基因法，发展了与S-1300的自交不亲和性连锁的SCAR标记（专利号：ZL200710053354.2）、与丙409自交不亲和保持性连锁的SCAR标记（专利号：ZL200810047237.X）。研究发现甘蓝型油菜普遍存在S单倍型（Zhang等，Theor Appl Genet,2008,117(2):171-179），上述SCAR标记在很多材料上检测不到，因而应用具有很大的局限。创建甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术，用来准确鉴别自交不亲和性，可解决选育自交不亲和系和恢复系效率低下因而杂种配合力不高的问题、并用于自交不亲和杂种纯度鉴定。这些相关内容，迄今还没有报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用同源基因法克隆甘蓝型油菜自交不亲和位点（又称S位点）基因，根据基因序列差异设计引物，找到可区分人工创建的自交不亲和甘蓝型油菜和天然的自交亲和甘蓝型油菜的S单倍型的SCAR（Sequence characterized amplified regions,序列特征扩增区域）分子标记，应用得到的SCAR分子标记对甘蓝型油菜自交不亲和表型进行快速而又准确的选择，用于选育自交不亲和系和鉴定自交不亲和两系杂种纯度，以加快油菜自交不亲和新品系的育成。 

具体地，本发明通过以下技术方案实现： 

申请人通过克隆甘蓝型油菜自交不亲和位点（又称S位点）基因，根据基因序列差异设计引物，筛选得到一套用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记组合，其包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，上述4个SCAR分子标记的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID NO：6，7，8，9所示。对这4个SCAR分子标记进行组合得到的2对双重PCR标记，分别是：SRK1-1+SRK-1300组合和SCR7-2+SRK-1300组合，上述双重PCR标记组合为共同组合使用或单独使用，其中将上述两个标记共同组合的使用效果会更好。 

试验表明，我们利用上述分子标记或其组合，创建了利用甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记体系改良自交不亲和系的方法以及用于鉴定甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度的方法。 

甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测技术及其应用，其具体步骤如下： 

A、甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型分子检测技术的创建：