[发明专利]一种深海弹性蛋白酶的低成本制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种深海弹性蛋白酶的低成本制备方法，特别是一种用牛心管发酵制备深海细菌弹性蛋白酶的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

弹性蛋白酶（elastase）是一种以分解不溶性弹性蛋白质为特征的广谱蛋白水解酶，由于弹性蛋白主要分布于血管、肺和皮肤等结缔组织中，因此弹性蛋白酶可以作为治疗高脂血症、防治动脉粥样硬化症、消除皮肤焦痂、碎屑等方面的生化药物，治疗确切，安全可靠；也可用于食品工业和化妆品工业。而由于弹性蛋白和革兰氏阳性细菌肽聚糖的肽段部分序列具有相似性，因此弹性蛋白酶有时也可以作为具有裂菌活性的溶菌酶。溶菌酶可用作天然的食品防腐剂，现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐，还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。溶菌酶还具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，目前医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。

地球上80%的生物存在于海洋，因此海洋生物资源总量巨大。目前的研究表明，海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的蛋白酶可能具有特殊的性质，预示着可能具有潜在用途。对于海洋微生物分泌的弹性蛋白酶国内外研究很少，总体开发利用程度非常低。细菌（Pseudoalteromonas sp.）CF6-2是从中国南海2441米深的海底沉积物中分离得到。研究表明，该菌株能够以弹性蛋白为诱导物分泌一种弹性蛋白酶。对CF6-2分泌的蛋白酶的结构和性质的研究表明，该酶是M23家族一个新型的蛋白酶，对弹性蛋白和肽聚糖都具有很高的降解活性，在治疗细菌感染和高血压疾病等医疗方面以及化妆品等方面都具有很好的应用潜力。但是利用弹性蛋白进行该酶的发酵成本较高，这严重影响了该酶的开发应用。因此，发明Pseudoalteromonas sp.CF6-2分泌的弹性蛋白酶的低成本发酵技术将为该酶的应用开发奠定基础。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种深海细菌弹性蛋白酶的低成本制备方法。

本发明技术方案如下：

一种深海细菌弹性蛋白酶的低成本制备方法，步骤如下：

（1）将深海细菌（Pseudoalteromonas sp.）CF6-2菌株接种于液体种子培养基，在15～18℃条件下振荡培养12～15小时，获得种子培养液；

所述液体种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

（2）按1～5%的体积百分比将步骤（1）制得的种子培养液接种于发酵培养基，经发酵培养后，离心取上清，制得发酵液；

所述发酵培养基组分如下，均为重量份：

心管粉0.8～1.2份，酵母粉0.1～0.5份，CaCl₂0.002～0.01份，Na₂HPO₄0.005～0.02份，人工海水100份，pH为8.0；

所述心管粉是由牛心管经过脱脂、冻干、研磨、过20目筛后制得；

（3）将步骤（2）制得发酵液经pH9.0的50mM Tris-HCl缓冲液过夜透析，离心，上清液以2ml/min速度穿过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱后用浓度为0～0.3M的NaCl进行梯度洗脱，取第一个洗脱峰的洗脱液，制得深海细菌弹性蛋白酶。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的深海细菌（Pseudoalteromonas sp.）CF6-2菌株是在温度为15～20℃条件下，于固体培养基活化培养1～2天后制得的。

根据本发明进一步优选的，上述固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的发酵培养，温度为18～20℃，时间为26～30h。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的离心条件为：5℃10000g离心10min。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的离心条件为：5℃10000g离心15min。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中分离纯化所用的层析柱尺寸为（55mm×10cm），纯化温度为4～6℃。