[发明专利]溶酪大球菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株溶酪大球菌，以及溶酪大球菌的制备方法和应用技术。 

背景技术

腐胺（putrescine）是一种有机化合物，常温下为无色晶体或无色至微黄色液体。腐胺的分子式为NH₂(CH₂)₄NH₂，也被命名为1，4-丁二胺、1，4-二氨基丁烷、四亚甲基二胺或腐肉碱。腐胺是工业上生产尼龙-46、尼龙-6及尼龙-66的原料，尤其是尼龙-46广泛用于汽车、摩托的零部件材料，而尼龙-66是电子产品的生产原料，酸性气体吸收剂。目前腐胺的制备方法主要有（1）由氰化氢与丙烯腈反应生成的丁二腈氢化而进行规模化生产；（2）在碳酸钠的作用下，由吡咯与盐酸羟胺反应得到丁二肟，再在钠汞齐作用下，经无水乙醇加热还原制备；（3）由2，5-二氨基戊酸加热催化脱羧制备；（4）以精氨酸脱羧、脱胍制备。由此可见，目前腐胺的生产方式主要以化学合成为主，能量消耗大，对环境也有污染。我国腐胺需求量较大，但国内企业生产能力和产品质量有限，从国外进口价格也很高，因此需要寻求高纯度腐胺的制备方法，以降低生产成本，减少对环境的污染。 

发明内容

本发明的目的是提供溶酪大球菌，并通过该菌的代谢特性发酵生产腐胺，获得高浓度的腐胺发酵液。 

本发明溶酪大球T17菌于2013年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC No.7623，分类命名：溶酪大球菌 Macrococcus caseolyticus。 

本发明另一目的是提供以上溶酪大球T17的筛选方法。 

本发明采用普通营养肉汤琼脂从市售制熟的盐水鸭产品中分离得到。 

在普通营养琼脂培养基37℃中菌落是乳白色，隆起，革兰氏染色阳性，普通显微镜下是球状。 

本发明容易分离提取，可以降低生产成本，减少化学合成造成的环境污染，使用该微生物发酵生产腐胺，发酵液中腐胺含量较高。 

本发明再一目的是提出以上溶酪大球T17在生产高浓度腐胺方面的应用。 

本发明是以溶酪大球菌T17为生产菌株，接种保存好的纯菌接种至普通营养肉汤液体培养基中，待菌株生长到对数生长期（OD值为0.6左右）；将该活化好的菌液按照1%的接种量接种到改良的普通营养肉汤培养基中，37℃220rpm振荡培养4-6天；将培养后的菌体发酵液10000rpm离心5min，此时的上清液即含有高浓度的腐胺，腐胺的含量在每升发酵液500mg以上。 

本发明直接以鸟氨酸为前体，通过一些特定的具有鸟氨酸脱羧酶活性的微生物的作用，可以获得高浓度的腐胺，然后从发酵液上清中分离腐胺，可以减少化学合成的污染，降低生产成本。由于本发明溶酪大球菌是从食品中分离获得，并且也是传统发酵肉制品中的一种菌，因此从该类菌中筛选到能产腐胺的菌株T17，该类菌不携带致病基因，发酵后的菌体也容易灭菌处理，使用该菌来发酵生产腐胺会比别的微生物发酵更为安全，不会造成有毒微生物和致病基因危害。 

本发明所述的改良普通营养肉汤培养基的成分是在普通营养肉汤培养基中添加质量百分比分别占1%和0.005%的L-鸟氨酸、磷酸吡哆醛。 

附图说明

图1为七种生物胺标样的分离效果图 

图2为以鸟氨酸为底物时，溶酪大球菌T17（CGMCC No.7623）的发酵上清液的高效液相图。

图3为溶酪大球菌T17的鸟氨酸脱羧酶基因序列和氨基酸序列。 

具体实施方式

一、溶酪大球菌T17的筛选和鉴定： 

1、准确称取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的标准品各50mg，用0.4mol/L的高氯酸（HClO₄）定容到50mL，配成1mg/mL储备液备用。

分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO₄配制成质量浓度分别为2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的混合标准溶液，铝箔避光、4℃冰箱保存备用。 

2、无菌条件下从每只制熟的盐水鸭中分别取5g鸭脖和鸭翅肉、15g鸭胸肉、10g鸭腿肉及10g鸭背肉，共40克混合捣碎，每只盐水鸭的鸭肉作为一个试验样品。