[发明专利]一种比伐卢定的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肽制备方法，尤其地涉及一种比伐卢定的制备方法。

背景技术

比伐卢定(Bivalirudin)是一种应用于临床的凝血酶抑制剂，早期的临床研究表明比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。比伐卢定可通过结合于催化剂位点和循环及凝血酶血块的阴离子输出位点而直接抑制凝血酶的作用。

比伐卢定(Bivalirudin，又名Angiomax)是人工合成抗凝药物，其抗凝成分为水蛭素衍生物C端20个氨基酸残基的肽。结构序列为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。比伐卢定属于强有力的凝血酶直接抑制剂，是近年来临床应用较广的药物。

关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。主要有固相依次偶联方法。由于比伐卢定结构中含有一个-Gly-Gly-Gly-Gly片段，因此在固相依次偶联-Gly过程中，Gly自身特性使得极易在主峰前后产生Bivalirudin-Gly和Bivalirudin+Gly的杂质，这两个杂质在后续分离时很难去除。中国专利201110170669和中国专利201110144317均采用了Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH作为反应原料来解决上述Gly杂质的问题。但是，上述专利方法需要自制，步骤繁琐，不利于工业化生产。

发明内容

为了解决以上缺点，本发明旨在找到合适的偶联条件，能够在顺序偶联的基础上，有效的控制Gly杂质的产生，以利于工业化生产。固相合成时，氨基酸偶联一般采用2h甚至更长的反应时间以确保偶联的完全。本发明意外的发现，在合成-Gly-Gly-Gly-Gly肽链时，通过提高氨基酸(Fmoc-Gly-OH)投料比例，并缩短反应时间，能够有效解决BIV合成中Gly杂质的问题。

本发明的第一方面提供一种比伐卢定的制备方法，包括以下步骤：

1)选择合适的固相载体；

2)制得Fmoc-Leu-固相载体；

3)脱除Fmoc保护后以1-3倍的投料比加入相应氨基酸进行偶联，从而依次完成Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联；

4)脱除Fmoc保护后以4-8倍的投料比加入Fmoc-Gly-OH进行偶联，重复偶联4次；

5)脱除Fmoc保护后以1-3倍的投料比加入相应氨基酸进行偶联，从而次完成Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH的偶联，得到比伐卢定肽树脂；

6)用裂解试剂将比伐卢定从肽树脂上裂解下来，得到粗肽；

7)所述粗肽经过纯化，转盐，最终得到精制比伐卢定。

在一些实施方案中，步骤1)中所述的固相载体为Wang树脂。

在另一些实施方案中，步骤4)中Fmoc-Gly-OH的偶联体系选自DIC/HOBt、HATU/HOAt/DIPEA、PyBOP/HOBt/DIPEA中的一种。在一个优选的实施方案中，步骤4)中Fmoc-Gly-OH的偶联反应时间为10min-30min。

在又一些实施方案中，步骤6)中所述的裂解试剂为TFA、TIS个H2O的混合物。在一个优选的实施方案中，TFA∶TIS∶H2O＝92∶4∶4(V∶V)。

在再一些实施方案中，步骤7)中所述的纯化为反相高效液相色谱纯化。在一个优选的实施方案中，所述反相高效液相色谱的色谱柱为反相C18柱。在另一个优选的实施方案中，步骤7)中所述的转盐是转成三氟乙酸盐形式。

具体实施方式

缩写及含义