[发明专利]辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测用引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测引物、检测方法及其应用。

背景技术

辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）是一种正单链RNA的杆状病毒，属于杆状病毒科（Virgaviridae）、烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员，在世界范围内广泛分布，是辣椒上最重要的可经种子传播的病原之一。PMMoV虽然在辣椒叶片上产生轻微或没有产生症状，但能引起果实退绿斑驳、畸型、变小，偶尔坏死，严重影响辣椒的产量和品质。此外，该病毒还可能是一个能够同时感染人类的植物病毒，已有报道指出该病毒与人的发热、腹部疼痛、瘙痒有关，并引起免疫反应。在我国，1989年报道在辽宁的辣椒上发生，1994年报道在新疆石河子辣椒上危害，而后发生危害的报道很少。但近5年来，先后在陕西、北京、宁夏、山东青岛、河北保定等地的辣椒上发现该病毒，具有危害地区越来越广、危害面积也在逐年增加的趋势。

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种在等温条件下高特异性、高灵敏性、快速地扩增DNA的核酸扩增方法。与传统的分子检测方法相比，该方法具有以下几个方面的优点：1）一般情况下，LAMP方法比传统的PCR方法具有更高的灵敏度高；2）由于LAMP通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增效应，因此能获得比PCR更高的特异性；3）LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，通常在30 min-60 min内即可完成反应过程；4）LAMP反应只需要恒温孵育器（或恒温水浴槽），设备简单，不需要更为昂贵的PCR仪；5）产物检测便捷多样，即可根据反应体系中是否形成白色的焦磷酸镁沉淀来定性判断，也可加入染料后进行颜色反应判定，或琼脂糖凝胶电泳判定，或利用LAMP实时浊度仪或实时荧光PCR系统进行实时检测判定。LAMP自从2000年诞生以来，已在植物病害检测中得到越来越广泛的应用，包括植物病原细菌、病毒、寄生虫等有害生物、转基因的检测中。

目前，除了利用传统的鉴别寄主、生理生化特征、电镜技术等常规方法进行PMMoV的检测鉴定外，还可以利用已建立的RT-PCR、实时荧光RT-PCR、基于DIG标记cDNA探针的分子杂交等分子检测方法，但还没有有关RT-LAMP方法的报道。本发明根据PMMoV基因组序列的保守区域设计引物，经条件优化后，建立了PMMoV的RT-LAMP方法，为PMMoV的快速检测提供一种新的分子检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供用于辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP检测的引物序列及其应用。所述RT-LAMP检测，即辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明通过分析已报道的PMMoV基因序列，设计特异性引物。所述的引物对由1对外引物和1对内引物组成，其外引物序列为PMMoV-F3：如SEQ ID NO：1所示，即为5’- CAGGTGGACTTCGGTCTT -3’、PMMoV-B3：如SEQ ID NO：2所示，即为5’- CAAGCTTTGAAAGGTACAGT -3’；其内引物为PMMoV-FIP：如 SEQ ID NO：3所示，即为5’- ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC-3’、 PMMoV-BIP: 如SEQ ID NO：4所示，即为5’- GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC-3’。

本发明还进一步提供了应用上述引物的RT-LAMP检测方法，其以样品总RNA为模板，进行RT-LAMP扩增，反应结束后根据是否产生典型的梯状条带判定结果。

本发明的反应条件可由两步RT-LAMP法或一步RT-LAMP法进行，其特征在于：

（1）两步RT-LAMP法的反转录反应和LAMP扩增反应两个过程分开进行，反转录反应的温度为42℃，LAMP扩增温度为65 ℃；

（2）一步RT-LAMP法的反转录反应和LAMP扩增反应同时进行，一步RT-LAMP法的反应温度为60 ℃。