[发明专利]一种Ezrin抗原决定簇多肽及其磷酸化Thr566抗体制备方法和采用该抗体制备的试剂盒

权利要求书

1.一种Ezrin抗原决定簇多肽，其特征在于包括以下的氨基酸序列：

CGRDKYKTLRQIRQ；

CGRDKYKT-^PLRQIRQ；

所述-P为氨基酸T添加磷酸化基团。

2.根据权利要求1所述的Ezrin抗原决定簇多肽，其特征在于所述抗原决定簇内不含有半胱氨酸的多肽的N端均添加半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述的Ezrin抗原决定簇多肽，其特征在于所述抗原决定簇内苏氨酸添加磷酸化基团修饰。

4.一种Ezrin磷酸化Thr566的抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、制备抗原，选择Ezrin的抗原决定簇多肽，在所述多肽的N端添加半胱氨酸，苏氨酸添加磷酸化基团并纯化，将纯化后的多肽与血蓝蛋白通过Sulfo-SMCC偶联形成全抗原；

步骤二、将所述全抗原按常规制备多克隆抗体的方法制备抗血清；

步骤三、将所述抗血清分离纯化，即得。

5.根据权利要求4所述Ezrin磷酸化Thr566抗体制备方法，其特征是：所述步骤一中，按重量比计算，多肽∶血蓝蛋白∶Sulfo-SMCC为4∶4∶1，血蓝蛋白的浓度为8mg/ml。

6.根据权利要求4和权利要求5所述Ezrin磷酸化Thr566抗体制备方法，其特征是：所述步骤三中，采用多肽偶联Sulfolink Gel层析柱亲和层析法进行双次层析柱分离纯化，首次使用磷酸化多肽制备的亲和层析住分离出磷酸化抗体与非磷酸化抗体的混合液，第二次使用非磷酸化多肽制备的层析柱分离出磷酸化抗体与非磷酸化抗体，其中多肽与偶联树脂的重量比为1∶1，偶联成功的胶与封闭液的体积比为1∶1，所述封闭液为50mM半胱氨酸。

7.一种Ezrin磷酸化Thr566基于细胞的快速试剂盒，其特征是：各组分配方、用量、反应时间：

清洗液：PBS200ul/孔，配方：NaCl8g，KCL0.2g，KH₂PO₄O.2g，NA₂PO₄·12H₂O2.85g，ddH₂O1L，pH＝7.4，反应时间：室温5分钟，3次；

淬火液：H₂O₂100ul/孔，配方：1mL30％H₂O₂加入29mL PBS，反应时间：室温20-25分钟；

固定液：多聚L-赖氨酸100ul/孔，配方：10ug/mL PBS，反应时间：室温1-2小时；

穿膜液：多聚甲醛100ul/孔，配方：质量分数为4％甲醛PBS重量体积比，适用贴壁细胞；质量分数为8％甲醛重PBS量体积比，适用悬浮细胞，反应时间：室温10-30分钟；

封闭液：质量分数为2％BSA，0.1％叠氮纳100ul/孔，配方：2％BSAPBS重量体积比，0.1％叠氮纳PBS重量体积比，反应时间：室温1-2小时；

抗体稀释液：1％BSA，0.5％Triton X-100，0.05％叠氮纳溶于PBS重量体积比中；

清洗液：154mM氯化钠，5.5mM磷酸氢二钠，1.2mM磷酸二氢钾，0.5％Tween20；

磷酸盐缓冲液：11.9mM磷酸二氢钠，137mM氯化钠，and2.7mM氯化钾溶于双蒸水。