[发明专利]雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法

说明书

【技术领域】

本发明具体涉及一种雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法。

【背景技术】

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)属卫矛科植物，主产于浙江、江苏、安徽、福建等地，尤以福建泰宁地区所产最优。雷公藤在我国已有数百年的药用历史，广泛应用于类风湿关节炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、麻风病及自身免疫性疾病和皮肤病，雷公藤成分至少有100多种，其中大约有70种具有不同的药理作用；而雷公藤的植物化学成分大体上可分成3类：生物碱类(如烟酰倍半萜、雷公藤碱、雷公藤定碱、雷公藤亭等)、二萜类(如雷公藤甲素、乙素等)和三萜类等成分(如雷公藤红素、雷公藤内酯甲、内酯乙等)。其中雷公藤甲素(triptolide)和雷公藤红素(celastrol)具有抗肿瘤、抑制免疫反应、抗炎和抑制血管生成等药理作用；而雷公藤次碱、雷公藤定碱(wilforine)、雷公藤酯甲(Wilforlide A)和雷公藤内酯酮(Triptonide)等也具有抗风湿、驱虫和抑制免疫反应等作用。而这其中，雷公藤甲素药理作用最为突出，其可以对美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)，所列出的全部60种癌细胞均具有良好的抗肿瘤活性，为此，雷公藤这一古老的、中国地产的植物药有望继青蒿素、紫杉醇提取物之后，成为又一种重要的植物新药来源。目前雷公藤单体如雷公藤红素和雷公藤甲素市场需求量较大，达到40kg/年，按照平均单价为40000万元/kg，其产值将达到1.6亿，但是目前国内年产量仅有10kg左右，而且更有甚者，由于国内外对雷公藤提取物的需求量巨大，导致雷公藤野生植物资源锐减，难于满足市场需求；而在另一方面，雷公藤属多年生木质藤本，生长缓慢，以生长8-20年的雷公藤根入药为最佳质量，大量的采伐，致使其野生资源遭到很大破坏，雷公藤资源已日趋接近枯竭。

而雷公藤药理活性成分多为雷公藤次生代谢产物，在原生药材中含量极低，例如以福建泰宁40年野生道地雷公藤去皮根为例，其原药材中直接化学提取的雷公藤甲素(TP)含量仅为0.012％(120 mg/kg)，生长年限在7年以下的，其含量更低，小于80 mg/kg。目前尽管TP的全化学合成法已有多条路线获得成功，但因路线太长(均在15步反应以上)，反应条件苛刻，收率低；或是需要采用部分毒性较大的原料，而不利于药物安全而无法实现绿色工业化生产。由于半合成法仍需要采用植物体的合成前体，因此化学合成方法难于从根本上解决雷公藤野生资源匮乏难题。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法，具有生产周期短、产率高、环保等优点。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：以野生两年雷公藤幼苗经室温二次栽培以后的新生根系为外植体，在MS培养基上培养愈伤组织，培养条件为：光照强度为1500lx-2500lx，温度25±1℃，18-25天形成愈伤组织；

步骤二：将成熟质地疏松的愈伤组织投入6，7-V培养基中，接种量为5g，置于转速为120r/min摇床上，振荡培养18天，18天继代一次，连续继代5-8代，即得雷公藤悬浮细胞液；

步骤三：调节所述雷公藤悬浮细胞液的pH至5.0，按照每200ml，10g的接种量，加入诱导子，在25℃、振荡速度为120r/min的摇瓶振荡培养18天；此后每隔3天检测反应体系的pH值使pH保持在5.0，当反应体系中的雷公藤甲素及其衍生物的总含量低于0.0001mg/L后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液，将上清液于8000 r/min，离心10min去除沉淀；

步骤四：将经过步骤三处理所得的上清液与等体积石油醚充分混合，于分液漏斗中静置至分层，弃去石油醚层，再用相对于所述上清液1/2体积的乙酸乙酯萃取3次，过中性氧化铝层析柱脱去色素，再用体积比为4∶1的石油醚-乙酸乙酯20ml淋洗，然后用体积比为4∶1的石油醚-乙酸乙酯60ml冲洗柱子，收集洗脱液；用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干，加3ml色谱纯甲醇溶解，过0.22μm微孔滤膜，即得产品。

进一步地，所述步骤一和步骤二之间还包括下述步骤：