[发明专利]猪细小病毒VP2亲和肽及其编码核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪细小病毒VP2亲和肽及其编码核苷酸，属于生物技术领域。 

背景技术

噬菌体表面展示技术(phage display random peptide library)是20世纪80年代发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项分子生物学新技术。噬菌体展示技术所选用的噬菌体载体是丝状噬菌体，包括f1，fd和M13噬菌体，其中M13噬菌体最为常用。这类单链环状DNA病毒颗粒的噬菌体，编码11种蛋白质，pIII、pVI、pVII、pVIII、pIX为其衣壳结构蛋白，其中pVIII蛋白为主要衣壳蛋白，构成噬菌体的管状结构，呈螺旋对称排列，pIII和pVII蛋白位于噬菌体外壳的尾端，是噬菌体吸附宿主菌的结构。目前大多数基于VP2的研究主要集中在PPV诊断和免疫方面；关于VP2在PPV感染过程中的作用机理研究方面的资料较少。 

目前猪细小病毒病在我国感染十分严重，阳性率可达90％以上，给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，其编码的多肽能自我装配成类病毒粒子，具有很强的免疫原性，是防治细小病毒病的主要蛋白。基于传统疫苗的一些弊端，人工设计合成多肽疫苗将成为可能。噬菌体展示技术在新型疫苗研制上具有独特的优势，一是：噬菌体所展示的抗原表位能保持一定的空间构象，能有效刺激几天产生免疫应答；二是：噬菌体本身既可以做为载体，又可作为良好的免疫佐剂，能增强免疫效果。同时，噬菌体展示肽库技术对淘选PPV的抗原表位，研究猪细小病毒表面分子及其结合的受体，以及病毒侵入宿主细胞的分子机制，研制更有效的抗细小病毒的药物具有重要意义。 

1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程手段，将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面。其基本原理为：选择合适的噬菌体为载体，利用基因工程技术将外源基因克隆到其载体上，同时将外源基因编码的融合蛋白在噬菌体颗粒表面展示出来，被展示的多肽保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于受体的识别和结合，从而组成含有多种短肽的库。外源蛋白或多肽的基因型和表现型的对应关系。 

噬菌体展示技术将基因表达与亲和选择相结合，其过程是将目的蛋白吸附于 固相载体上，如酶标板或颗粒物质。原始肽库噬菌体与靶分子短时间孵育，洗去未结合的噬菌体，然后用特定的洗脱液将与靶蛋白特异性结合的噬菌体洗脱下来。扩增洗脱后的噬菌体，然后进行下一轮淘选，经过3～4循环的“吸附-洗脱-扩增”后，最终得到高度富集与靶蛋白结合的序列，然后通过酶联免疫吸附试验进一步鉴定筛选，获取真正的目的克隆，通过测定DNA序列，推导其氨基酸序列。最后合成多肽进一步研究其生物活性。 

发明内容

本发明的目的在于通过噬菌体展示肽库技术淘选PPV的抗原表位，提供一种猪细小病毒VP2亲和肽A和B及其编码核苷酸。 

本发明的目的通过下述技术方案实现： 

1、一种猪细小病毒VP2亲和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。 

2、如上所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽A的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。 

3、另外一种猪细小病毒VP2亲和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。 

4、如上所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽B的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。 

5、一种VP2序列的的扩增引物VP2-3和VP2-4，核苷酸序列为： 

VP2-3：5’-GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’； 

VP2-4：5’-CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’。 

本研究相对于现有技术，有如下有点及有益效果：利用噬菌体随机十二肽库技术淘选出了与VP2蛋白特异性结合的多肽。人工合成此短肽，对防治猪细小病毒病提供了一定的理论基础和试验依据。在此基础上我们拟利用病毒学实验技术分析并特性鉴定的多肽在细小病毒感染周期中的作用，为PPV感染和致病机理的研究提供重要理论依据，也为寻找PPV VP2抗原表位及病毒侵入细胞机制提供了重要的理论依据。本发明的多肽由于分子量较小，易穿透进入组织，比大蛋白渗透能力更强；半衰期短，在组织中蓄积很少(减少其代谢物引起并发症的风险)；结构稳定且生产成本较低。 

附图说明

图1是VP2基因的PCR扩增结果； 

其中M是Marker，1是VP2基因的扩增片段，2是阴性对照；