[发明专利]核酸的定量、高度多重检测

说明书

联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明

本发明是在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府对本发明拥有某些权利。

相关申请的交叉参考

本申请涉及2011年2月18日提交的美国临时专利申请第61/463,580号和2011年11月17日提交的美国临时专利申请第61/561,198号的优先权，所述专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明是实时DNA扩增、检测和定量的领域，以及相关耗材(consumable)、装置和系统（包含阵列）。

技术背景

实时PCR通常用于生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述见例如M TevfikDorak(编者)(2006)Real-time PCR(Advanced Methods)（实时PCR（高级方法））TF公司（Taylor&Francis），第一版ISBN-10:041537734X ISBN-13:978-0415377348，和Logan等(编者)(2009)Real-Time PCR:Current Technology and Applications（实时PCR：现有技术和应用），Caister学术出版社，第一版ISBN-10:1904455395,ISBN-13:978-1904455394。其他细节也见例如Gelfand等，“Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity of A Nucleic Acid Polymerase（使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均匀测试系统）”USP5,210,015;Leone等，(1995)″Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA（分子信标探针与NASBA扩增的结合能均匀实时检测RNA）″Nucleic Acids Res.26:2150-2155;和Tyagi和Kramer(1996)“Molecular beacons:probes that fluoresce upon hybridization（分子信标：基于杂交的荧光探针）”Nature Biotechnology14:303-308。通常，用于在单反应容器(如多孔板的孔)中检测各样品多于一个靶标核酸的单细胞多重技术（multiplexing），这是使用对各扩增子特异性的自体淬灭PCR探针例如TAQMAN^TM或分子信标探针来实现。一旦在溶液中结合扩增子，或一旦PCR中探针的降解，所述探针不淬灭（unquench），而生成检测信号。所述探针用不同波长的荧光团标记，使得多重技术在单个“单罐式”反应中多至约5个靶标。由于实践光谱范围和标记释放限制，难于实现各反应多于约5个探针。这严重限制了单个反应的多重技术，进而严重限制了各样品能筛选多少个靶标和提高了在检测感兴趣多个靶标中的成本和设备复杂性。

核酸阵列代表多重检测扩增产物的另一种方法。更常见地，在样品上进行扩增反应，并且扩增子在核酸阵列上分别检测。例如Sorge“Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure（使用包含二级结构探针检测靶标核酸的方法）”US 6,350,580提出了通过从扩增混合物中纯化探针并且检测探针来捕获基于扩增释放的探针。这种生成和检测扩增子的多重步骤方法使得实时分析扩增混合物是不现实的。