[发明专利]单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种利用切刻内切酶恒温扩增(NEMA)技术进行菌样的快速检测的方试剂盒及其应用。

背景技术

1929年，Nyfeldt第一次从病人体内分离出单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，它是一种重要的人畜共患病和食源性疾病的病原菌。李斯特菌病的发病率很低，但是致死率高达20％～30％，在新生儿和免疫低下的人群中更高达70％。单核细胞增生李斯特氏菌在自然界中分布广泛，研究表明，由单核细胞增生李斯特氏菌引起的食物中毒主要发生在水分活度较高的食品当中，例如，肉类、禽类、乳及乳制品、水产品等。其中，乳制品的污染率为5％～10％，肉及肉制品的污染率为30％，家禽的污染率为15％，水产品的污染率为4％～8％。该菌在我国被列为21世纪影响中国人健康的十二种病原微生物之一。在2000年，WHO食品安全工作计划提出将单核细胞增生李斯特氏菌列为重点检控的食源性致病菌之一。因此，需要建立一种有效的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理如下：

(1)设计一对5′端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；

(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；

(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切口，暴露其3′端；

(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3′端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；

(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列；

(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测。

核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物10μL加入检测板的样品孔中，再加入100μL缓冲液进行层析，10min左右判读结果。

通用型核酸扩增物快速检测板的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中为检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。

本发明的一个方面涉及单核细胞增生李斯特氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1：

5-GCAAAACCTGGTGATGCTCTTCTCTTTGACTATGGTAGCGGAAT-3；反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-GCTGTCTAGATATAGCTCTTCGCCAGAGCCGTGGATGTTA-3。

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

P1：5-TGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACG-3    5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-GTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTG-3  3端标记FITC。

本发明的另一个方面涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，包括如下的组分：

(1)模板预处理反应液：

其中包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase2.5U；