[发明专利]一种海参体壁总DNA提取方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种海参体壁总DNA提取方法。

背景技术：

海参体壁中含有丰富的胶原、黏多糖和多种微量元素，具有较高的营养价值和药用价值。在我国被认为是传统的美味和滋补品。全球可供食的海参种类约50多种，作为名贵的海产品，市场上海参通常加工为干品或冻品出售，海参经过多道工序加工成干品后，很难从外部形体上分辨出其种类。目前在市面上销售的海参产品，大多根据其颜色和产地来命名贴标，如“美国红参”、“非洲海参”等，缺乏规范的商品命名，海参市场贴标混乱。

根据海参线粒体DNA片段如COI和16S rDNA序列，可以从分子水平鉴定海参种类和开发出简便的种类鉴别方法。由于海参含有丰富的黏多糖和蛋白质，造成DNA的提取比较困难，尤其是高质量DNA的获得，DNA中多糖等杂质过多会影响后续PCR扩增等分子生物学实验，进而影响了海参种类的分子鉴定。另外，干海参经过加工处理，其核基因组DNA已降解，与核基因组DNA相比，线粒体DNA结构简单、稳定，拷贝数多，可以用于海参种类的分子鉴定。

发明内容：

本发明的目的是为解决现有技术中存在的上述问题，提供一种能对海参酒精保存样品和干品均适用的海参体壁总DNA提取方法，该方法提取的DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。

本发明的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）样品预处理：第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为：200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8.0；

（b）样品的裂解：将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65℃消化30~60min，每隔5~10min混匀一次，待样品消化彻底后，12000g/min离心2~3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水；

（c）样品消化液用氯仿：异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min离心12-15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成；

（d）用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。

所述的步骤（a）的将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精优选为取海参的酒精保存样品在PBS溶液中放置3-6min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤（a）的将海参干品用PBS溶液浸发是将海参干品在PBS溶液放置30-60min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤（a）的固液分离是在10000-12000g/min离心1-2min，弃上清液；重复操作2次。

所述的步骤（c）的样品消化液用氯仿：异戊醇抽提优选为样品消化液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇中，充分混匀，静止1-2min，12000-13000g/min离心12-15min，取上清液；重复操作2-3次。

本发明中的PBS溶液是现有技术中的产品，其为137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，余量为水，pH7.2。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）使用PBS置换出酒精保存样品中酒精和浸发干海参样品，可提高提取DNA的获得量；

（2）在高盐缓冲液中剪碎组织样品，可除去样品中胞外多糖和色素等，降低它们对提取DNA的影响；

（3）样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液，即可快速的裂解组织，又有利于去除多糖；

（4）异丙醇高盐溶液沉淀DNA，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，消除多糖对DNA质量的影响；