[发明专利]一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法和专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的一种世界范围的水稻病害，该病害引起水稻结实率和千粒重显著降低，甚至植株倒伏枯死，是造成水稻减产的主要原因之一。水稻纹枯病菌属于立枯丝核菌的AG-1融合群，其基因组序列未知，这也为该病原菌的深入研究带来一定困难。随着矮秆、早熟、多蘖型品种的大量推广，以及施肥水平的不断提高，水稻纹枯病危害逐步加重，近年来已成为我国水稻三大病害之首，严重影响了水稻产量和质量。

目前对水稻纹枯病的防治以化学措施为主。噻呋酰胺（thifluzamide）商品名为“满穗”，是陶氏益农公司开发的噻二唑羧酰苯胺类化合物，是近年来推出的新型、高效防治纹枯病药剂。噻呋酰胺属于呼吸抑制剂中作用于复合物II处的琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs），这类药剂还包括萎锈灵、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等，它们具有相似的作用机制和抗性机制，相互间具有正交互抗药性，多对担子菌或子囊菌特效。使用初期，这类药剂因其用药量少，防效显著而备受青睐，但因其作用位点单一，田间很快就产生了抗药性。已有研究发现，病原菌对此类药剂的抗性机制主要是琥珀酸脱氢酶B、C、D亚基（sdhB、sdhC、sdhD）发生点突变所致，如玉米瘤黑粉病菌、小麦壳针孢叶枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三个半胱氨酸簇的保守组氨酸位点发生点突变，灰盖鬼伞病菌、菌核病菌等则在膜锚蛋白sdhC、sdhD位点发生点突变，脱氮副球菌在sdhB、sdhD发生点突变，而链格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均发生突变。水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性机制目前还未明确，明确其具体的抗性基因及抗性检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展动态，制定合理的病害管理方案，延缓抗药性的产生。

传统的抗性检测方法主要为室内生物学测定，包括菌丝生长速率法、孢子萌发法、菌丝干重法、水平扩散法等。这些传统的敏感性测定方法均需要制备含药培养基，计算抑制中浓度，耗费时间长，工作量大，灵敏度低。随着分子生物学的快速发展，分子技术得以在抗药性检测中应用，其速度快，效率高，是田间抗性检测的理想方法。针对单碱基突变引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功应用于抗性菌株的分子检测。等位特异PCR（Allele-Specific PCR,AS-PCR）是在引物的3’端设计一个碱基与突变位点匹配，在PCR扩增时引物只与突变菌株结合，敏感菌株的DNA则不能扩增，从而将敏感和抗性菌株区分开来。最近的研究发现，在原引物基础上，改变倒数第二个碱基为不同核苷酸后，可以显著提高引物的特异性，使得AS-PCR技术应用更为广泛。CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)是酶切扩增多态性序列标记技术，也称为PCR-RFLP技术，敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差异可能导致了酶切位点的改变，对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切，经电泳分离后敏感和抗性菌株的表型不同，从而加以区分。

发明内容

本发明的一个目的是提供两种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。

本发明所提供的第一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出条带，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。

上述过程中，所述sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO：4中自5’末端起第975位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为56℃。

本发明所提供的另一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，扩增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切产物中含有230bp片段，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点；