[发明专利]一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定啤酒酵母单倍体的方法，特别是一种基于菌落PCR和流式细胞技术的方法，属于微生物鉴定领域。

背景技术

酵母是啤酒酿造的灵魂，对啤酒质量起至关重要的作用。工业啤酒酵母包括上面酵母(ale brewing yeast，Saccharomyces cerevisiae)和下面酵母(lager brewing yeast，Saccharomyces pastorianus)两大类，市售啤酒90％以上是由下面酵母发酵而成，所以对工业啤酒酵母的研究也大多是针对下面酵母的。

下面酵母又称卡尔酵母，为异源杂合的多倍体或非整倍体，他们复杂的倍性给酵母改良和遗传研究带来了诸多困难。酵母单倍体菌株只有一套染色体，基因情况简单明了，常被用作遗传学和育种工作的模式菌株，既为性状遗传分析所必需，又可为杂交作好亲本的准备。而且，单倍体菌株具有细胞小、蛋白酶A产量低、自溶性能好等优势，在理论研究和实际应用中都具有深远意义。但因为工业啤酒酵母长期生活在营养充足的环境里，产孢能力退化，单倍体分离率和成活率低，而且缺乏行之有效的鉴定方法，因此此方面的研究并不多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是建立一种能精确、高效鉴定啤酒酵母倍性的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：首先采用菌落PCR进行初步判定，然后通过流式细胞仪检测DNA含量确定倍性；菌落PCR的特异性引物为：

MAT特异性引物(5′-AGTCACATCAAGATC GTTTATGG-3′)；

MATa特异性引物(5′-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3′)；

MATα特异性引物(5′-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3′)。

本发明的具体检测步骤如下：

(1)待检测的菌种稀释涂布YEPD平板，28℃培养2-3天后，用牙签小心挑取适量菌体到1.5mL离心管，为避免琼脂干扰PCR结果，可先将细胞洗涤2-3次，收集菌体后进行菌落PCR。

(2)PCR反应中所用三种引物分别为：MAT特异性引物(5′-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3′)；MATa特异性引物(5′-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3′)；MATα特异性引物(5′-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3′)。PCR反应体系中(100μL)加入适量细胞、三种引物各2μL、dNTP 8μL、10×buffer 10μL、rTaq酶0.5μL、ddH₂O 75.5μL，适当混匀后置于TECHNE TC-5000PCR仪进行PCR反应，条件为95℃变性5min；94℃变性1-2min，50℃退火30-60s，72℃延伸1-2min，25-40个循环；72℃总延伸5min。。

(3)PCR产物进行1.2％-2％的琼脂糖电泳。单倍体菌株的电泳结果只有一条条带，其中MATa型的为544bp，MATα型的为404bp，杂合二倍体和多倍体菌株同时有两条条带，纯合二倍体和多倍体菌株只有相应的一条条带。

(4)选取电泳结果只有一条条带的菌种(单倍体或纯和多倍体、杂倍体)进行流式细胞分析。

(5)将选出的菌株与单倍体标准菌分别接种于YEPD液体培养基，28℃振荡培养12-24h。取0.5-1mL菌液到1.5mL离心管中，8,000×g-12,000×g离心5-10min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤2-3次，然后用PBS溶解。

(6)将菌液沸水浴2-8min杀死细胞。加入10-12μL 10mg/mL的RNaseA，50℃水浴30-50min，然后加入20-24μL 20mg/mL proteinase K，50℃水浴30-50min。离心后收集菌体，重悬于PBS后适当稀释，超声10-20s，间隔2-3s，重复2-3次。

(7)上机前每mL样品加入5-10μL 1mg/mL的碘化丙锭(PI)，避光反应5-10min。

(8)样品倍性用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行分析。超纯水作为流动鞘液，用氩离子激发荧光，激发波长为488nm，使用660/16nm带滤光片作PI荧光分析，每个样品至少检测1×10⁴个细胞，得到FCM图谱。