[发明专利]应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法

说明书

技术领域

本发明属于功能性食品开发技术领域，涉及功能性食品活性成分多糖的分离纯化方法和黑木耳的利用，特别是一种从黑木耳中分离制备具有抗肿瘤活性多糖的方法。

背景技术

黑木耳是一种营养丰富的食用菌，不仅具有显著的抗凝和阻止胆固醇在血管上的沉积，防止血栓形成的作用，而且我国中医证实黑木耳具有很好的抗肿瘤效果，根据文献报道黑木耳的抗肿瘤效果与存在的黑木耳多糖具有很大关系。目前黑木耳多糖的分离方法主要是采用柱层析色谱（轴色谱）方法，采用径向色谱分离具有抗肿瘤的作用的黑木耳多糖未见文献报道。

现有的关于抗肿瘤活性多糖的方法主要是采用柱层析色谱方法，其局限是分离效率低、分离速度慢，其次，柱层析色谱方法大批量制备较困难。

现有的黑木耳多糖，其结构式为： 

其存在的缺陷主要为：对抗结肠癌活性不明显，只有一定的清除自由基活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种分离效率高、分离速度快的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法，包括如下步骤：

1）、将黑木耳放入65~70℃热水中保温浸提160~200 min，得黑木耳多糖提取液；

2）、将黑木耳多糖提取液浓缩，得浓缩液；浓缩液中碳水化合物的含量为2.5~3.0mg/ml；

在浓缩液中加入占浓缩液体积40~60%的Savag试剂，震荡离心（例如为3000rpm离心15~20min）后，所得的上清液为去除蛋白的多糖水溶液；

3）、在去除蛋白的多糖水溶液中加入体积浓度≥95%的乙醇进行醇沉，得沉淀；体积浓度≥95%的乙醇是去除蛋白的多糖水溶液体积的1.8~2.2倍；

将沉淀用体积浓度≥95%的乙醇进行清洗（例如清洗两次）；得含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖；

4）、将含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖冷冻干燥，得冻干后的黑木耳粗多糖；

5）、将冻干后的黑木耳粗多糖按照1g/15~20ml的料液比溶于蒸馏水中，得样品溶液；

将样品溶液泵入径向色谱仪，样品溶液的上样量为25~50ml；选用DEAE-52纤维素作为填料；分别用以下2种洗脱剂进行洗脱：蒸馏水和浓度为0.2M的 NaCl溶液，流速均为7.5~8.5ml/min，每种洗脱剂的洗脱时间55~65min； 

6）、收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液，依次经透析、浓缩、干燥，得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖。

作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的改进： Savag试剂由氯仿:正丁醇＝3:0.9~1.1的体积比混合而得。

作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进：步骤6）为：收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液，用截留分子量为7000~9000Da的半透膜透析20~28h，再用旋转蒸发仪浓缩，直至所得的浓缩液为原体积的10%~12%；再冷冻干燥至恒重。

作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进：

步骤1）的浸提中：黑木耳与热水的料液比为：1g/20~25ml；

步骤2）的浓缩为用旋转蒸发仪浓缩。

作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进：所述步骤2）和步骤6）的旋转蒸发仪浓缩均为：真空度≤110Pa，温度为39~42℃；

步骤4）和步骤6）的冷冻干燥的真空度≤80Pa，温度为-45~ -55℃。

作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进：步骤4）和步骤6）的冷冻干燥前，先于-70~ -80℃快速冷冻3.5~4.5h。

本发明还同时提供了上述方法分离而得的黑木耳多糖，其结构式为：

。

采用本发明方法分离所得的具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖粉末，纯度达93%以上。

本发明的步骤1）的浸提，为了提高得率，步骤1）的浸提次数1~3次，即，可对滤渣进行反复浸提。

在本发明的步骤2）中，较佳为：在浓缩液加入占浓缩液体积50%的Savag试剂， Savag试剂为氯仿:正丁醇＝3:1（v/v）。

在本发明的步骤3）中，较佳的醇沉时间为≥120分钟。