[发明专利]组合物及甲硫氨酸的生产方法

说明书

本申请是2007年4月11日提交的中国专利申请No.200780052545.5的分案申请。

技术领域

本发明公开了组合物，以及用如微生物、酶和化学物质生产甲硫氨酸及相关产物的方法。

背景技术

甲硫氨酸是动物食谱中的必需氨基酸。长期以来，甲硫氨酸的制备是采用丙烯醛、甲硫醇和氰化物作为起始物质，通过各种多步化学反应合成的。有两种产物形式：D，L甲硫氨酸及其羟基类似物。与其它氨基酸不同，D-甲硫氨酸在体内转化为必需的L-异构体。据报导，由于家禽需求量的增加和近来作为猪饲料添加剂，饲料级甲硫氨酸的市场在不断扩大。甲硫氨酸的主要生产商(Degussa AG，Adisseo和Novus)满足市场需求的能力取决于原料供应。中间产物丙烯醛和甲硫醇必须转化为3-甲基硫丙醛(3-methylthiopropionaldehyde，MMP)并通过氢氰酸进一步转化成甲硫氨酸。所有这三家生产商都计划增加甲硫氨酸的生产设备并与原料生产相结合(Chem.Marketing Reporter April 7，2003)。

对大量生物体的甲硫氨酸的生物合成途径(天冬氨酸家族成员)的研究显示出相似和差异。最初确定的反应步骤为高丝氨酸在高丝氨酸酰基转移酶(homoserine acyltransferase)的催化作用下发生酰化反应，除了发生转移的酰基有所不同，它普遍存在于所有生物体中。metA催化作用的产物为乙酰高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸。乙酰高丝氨酸随后通过转硫途径或定向巯基化途径转化为高半胱氨酸。两种途径都被报导存在和作用于酵母、真菌、绿色植物和棒状杆菌属(Corynebacterium glutamicum)的细菌中。大肠杆菌(E.coli)仅采用转硫途径。转硫途径以胱硫醚作为中间产物并由半胱氨酸作为硫供体。定向巯基化途径包括将硫化物直接整合到酰基高丝氨酸。该途径中的最后一步为高半胱氨酸在高半胱氨酸转甲基酶(homocysteine methyltransferase，由metE或metH基因编码)的催化作用下转化为甲硫氨酸。

其它用于动物饲料的重要的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸通过发酵制备。因此，这些氨基酸可由葡萄糖和其它再生资源作为起始物质生成。遗憾的是通过发酵的方法生产甲硫氨酸并不成功，至今仍采用甲硫氨酸的化学合成。这其中部分原因是由于缺少有效构建的生产甲硫氨酸的生物合成途径及生产甲硫氨酸的合适生产宿主。

下面公开了改良的甲硫氨酸生物合成途径及其生产宿主。

发明内容

概述

通过发酵的方法生产甲硫氨酸及相关产物如S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAMe)的过程在此描述。基因工程化的含有重组DNA分子并生产甲硫氨酸的微生物也描述于此。

本发明描述了含有具有定向巯基化活性的外源核酸序列编码的肽(EC 2.5.1.49，EC 4.2.99.-)，并含有具有转硫活性的内源核酸序列编码的肽(EC 2.5.1.48和4.4.1.8)的微生物。该微生物能产生甲硫氨酸及相关产物。在一些例子中，该微生物能产生至少0.1，1，2，5，10，50，75，90或100g/L胞外浓度的甲硫氨酸或SAMe。

在一些例子中，存在不止一种甲硫氨酸的生物合成途径，较之在缺少外源核酸序列(其编码的肽具有定向巯基化活性)的条件下，允许生物体产生更多的甲硫氨酸。

在其它的例子中，在生物体中活跃着两种以上的甲硫氨酸生物合成途径。在这些例子中，一个或多个外源核酸序列编码的肽具有定向巯基化活性。其中的一种肽能够以O-琥珀酰高丝氨酸作为底物，另一种肽能够以O-乙酰高丝氨酸作为底物。

在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，所产生的至少10%的甲硫氨酸来自于转硫生物合成途径。在另一些例子中，它们产生的至少20，30，40或50%的产物来自于转硫生物合成途径。

在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，由定向巯基化生物合成途径活性，产生至少10%的甲硫氨酸。在另一些例子中，它们由定向巯基化生物合成途径，产生至少20，30，40或50%的产物。