[发明专利]尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表达载体、宿主细胞和重组蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）的血凝酶（haemocoagulase HCA）基因及其应用。

背景技术

在蛇毒众多复杂的活性成分当中，其中一类丝氨酸蛋白酶，具有精氨酸酯酶活性，能使纤维蛋白原特定部位Arg-Gly肽键断裂，释放出血纤肽而转换为纤维蛋白，作用与血浆凝血酶十分相似，称之为类凝血酶。大多数蛇毒类凝血酶只能裂解纤维蛋白原的Aα链或Bβ链，释放出血纤肽A（FPA）或B（FPB），并形成非交联的纤维蛋白单体。蛇毒类凝血酶在体外所起凝血作用与凝血酶相似，可不通过体内各种凝血因子直接使纤维蛋白原凝聚，但在体内，由于生成的非交联的纤维蛋白凝块较脆弱，极易被血液中的纤溶系统降解而从血液循环中清除。虽然类凝血酶在体外都能使血浆和血纤维蛋白原凝固，但在体内，不同的类凝血酶却表现为截然相反的两种药理作用：一种为具有抗凝作用的类凝血酶，以来自马来红口蝮(Calloselasma rhodostoma) 的 Ancrod为代表，因其能有效降低血液的纤维蛋白原水平而广泛应用于治疗各种血栓疾病当中；另一种为具有止血作用的类凝血酶，也称蛇毒血凝酶，以来自巴西矛头蝮（Bothrops atrox）的巴曲酶（Batroxobin）为代表, 体内注射后能够加速出血部位的血液凝结，减少伤口的出血时间，因而在各种外科手术和治疗各种出血性疾病当中得到广泛的应用。

由于人凝血酶直接入血易导致血栓形成，除局部外用外，不能用于体内出血性疾病的治疗。因此，用蛇毒血凝酶替代人凝血酶一直是止血药物技术领域研究的重点，目前应用最广泛的是立止血。立止血中包含两种成分：巴曲酶和微量的凝血因子X脂依赖性激活剂(FXA)，巴曲酶是分离自巴西矛头蝮蛇毒的单链糖蛋白，其分子量为43KD。国内已有临床使用的蛇毒血凝酶是白眉蝮蛇毒血凝酶，该酶由3种组分构成，其组分的相对分子量分别为54000±5000 Da、34000±5000 Da和15000±3000Da，相对百分含量为7.0%～12.0%, 76.0%～82.0%和7.0%～12.0% ，由类凝血酶和类凝血激酶组成。另一种由尖吻蝮(Agkistrodon acutus）蛇毒提取的血凝酶，该酶分子量为30KDa，由A、B两个亚基构成，A链由135个氨基酸组成，B链由126个氨基酸组成。

本发明人此前曾提出“尖吻蝮蛇毒36KD单链血凝酶及其制备方法”（发明专利ZL200610048673X），其分离纯化方法为DEAE-Sepharose XK50/60；Metal Sepharose F.F XK50/30柱；Superdex 75 XK50/100柱和Sephacryl S－100 XK50/100柱层析。

以下HCA含义为尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）的血凝酶（haemocoagulase）的英文缩写。

发明内容

本发明的目的是基于上述理论研究和技术，提供一种尖吻蝮蛇血凝酶基因及其氨基酸的全序列结构，该基因表达的蛋白具有在体内出血处快速止血的效果，其核苷酸序列既可以通过分子生物学方法从尖吻蝮蛇毒腺中获得，也可通过人工合成方法获得。

本发明的目的还包括了利用该基因构建表达载体，利用宿主细胞获得重组尖吻蝮蛇毒36KD单链血凝酶的方法。

本发明的目的通过如下方法实现：

（一）36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因

该基因自5’端至3’端由783个核苷酸编码组成，DNA序列为SEQ ID NO：2；该基因编码的单链糖蛋白的成熟蛋白含236个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其中含24个氨基酸残基的信号肽部分；该基因编码的单链糖蛋白的分子量为36±3 KDa，等电点为6.59。（SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2如氨基酸和核苷酸序列表所示。）

（二）一种克隆36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法

包括步骤：

（1）活体尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺总RNA；

（2） cDNA第一链合成（mRNA）反转录

在DEPC处理的PCR管中加入以下溶液：