[发明专利]尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表达载体、宿主细胞和重组蛋白的制备方法

权利要求书

1.36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因，其特征是该基因自5’端至3’端由783个核苷酸编码组成，DNA序列为SEQ ID NO：2；该基因编码的单链糖蛋白的成熟蛋白含236个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其中含24个氨基酸残基的信号肽部分；该基因编码的单链糖蛋白的分子量为36±3 KDa，等电点为6.59。

2.根据权利要求1所述的血凝酶基因，其特征是该基因具有以下特征：

（1）精氨酸酯酶活性

该基因编码的蛋白（36KDa-HCA）能水解精氨酸甲酯（TAME）和精氨酸乙酯（BAEE），活性分别为158435 U/mg和332518 U/mg；

以TAME为底物测定36KDa-HCA精氨酸酯酶活性，该酶在温度20℃～50℃和pH 6.0-10.0的条件下较稳定；在温度高于60℃时活性下降，70℃下降40～45%、80℃活性下降45～55%、90℃活性下降50～60%；

在pH2.0、3.0、11.0条件下，活性分别为pH7.4时的40～45%、45～55%和65～75%；

Zn²⁺、Cu²⁺、苯甲基磺酰氟（PMSF）、β-巯基乙醇、抑肽酶和苯甲脒能够抑制该基因蛋白的精氨酸酯酶活性，其中，Zn²⁺ 和PMSF的抑制率分别为35～40%和90～98%；

（2） 纤维蛋白原水解活性

该36KDa-HCA在15min内优先降解牛纤维蛋白原的Aα链，且水解活性呈剂量与时间依赖性关系。

3.一种克隆如权利要求1所述的36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法，其特征是：

（1）活体尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺总RNA；

（2） cDNA第一链合成（mRNA）反转录

在DEPC处理的PCR管中加入以下溶液：

Total RNA0.2~2mgOligo (dT)15 (20mM)1mLdNTP Mixture (10mM each)1mL5×M-Mulv RT Buffer   4mLM-Mulv反转录酶（200u/mL）   1mLRnase Inhibitor (40 u/mL)   0.5mLRnase Free H₂OUp to 20 mL

PCR反转录反应条件：30℃ 5min，42℃ 30~40min，95℃ 5min，产物4℃保存；

（3） PCR扩增类凝血酶基因

以反转录cDNA产物作为扩增尖吻蝮蛇类凝血酶基因序列的模板，引物如下：

TLE-ZQ（ SEQ ID NO：3）

5'-GCAGAGTTGAAGCTATGGT-3'；

TLE-P4 （SEQ ID NO：4）

5'-AAGGCAGTCCTATTTGAGTCTAA-3'；

采用Ex Taq PCR聚合酶进行扩增，PCR扩增条件：94℃3 min; 94℃ 0.5min, 60℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环，72℃延伸10min；

（4）筛选36KDa-HCA基因克隆

使用引物F1 （SEQ ID NO：5）：5'-GGAGGTAATGAATGTGACAC-3'和R1（SEQ ID NO：6）：5'-GAGTCTAAAAAAAGCTTACTG-3'进行菌落PCR，筛选血凝酶36KDa-HCA基因克隆；

PCR条件94℃3 min; 94℃ 0.5min, 60℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环，72℃延伸10min。