[发明专利]一种抗氧化肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种抗氧化肽的制备方法。

背景技术

自从英国Harman于1956年提出自由基理论以来，人们逐步认识到人体许多慢性疾病如糖尿病、心血管疾病、神经组织退化紊乱、癌症及衰老都与体内氧化产生的自由基有关，因而抗氧化剂的研究越来越被人们所关注。传统使用的抗氧化剂大多为合成抗氧化剂，如二叔丁基羟基甲苯(BHT)，叔丁基羟基茴香醚(BHA)，由于廉价而且具有很强的抗氧化能力而被广泛使用，但是由于其对人体健康构成潜在的危害而被限制使用。因此，寻找和开发安全、无毒的天然抗氧化剂，已成为当今社会的研究热点。

天然抗氧化肽是存在于动植物体中具有抗氧化活性的肽类，它具有清除自由基、螯合金属离子、猝灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，易被人体吸收，无毒副作用，营养和加工特性良好，因此在人类食品和药品中具有巨大的开发前景。目前也有很多学者采用酶解的技术从植物或者动物组织中制备得到活性很强的抗氧化肽。发明申请专利（申请号201010141974.3）公开了一系列的胶原蛋白抗氧化肽，具有如下之一的氨基酸序列：(1)Hyl-Cys；(2)Gln-Gly-Ala-Arg；(3)Leu-Gln-Gly-Met；(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp，该产品抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分，而且具有分子量小的特点，易被消化道直接吸收。发明申请专利（申请号200510009423.0）公开了通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等强度的强抗氧化能力的三种抗氧化肽，氨基酸序列为：(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。

花生粕是花生仁经过榨油后的副产物，含有丰富的蛋白质，但由于在榨油过程中经历了高温压榨和溶剂浸提的过程，导致花生蛋白严重变性，色泽和气味恶化，目前主要用作饲料或肥料。但是我国每年有几百万吨的花生粕，来源广泛、价格低廉，因此如何充分开发利用花生粕中的蛋白质资源，提高其附加值，是植物蛋白资源综合利用的重要环节。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种原料来源丰富廉价，且抗氧化活性很强的抗氧化肽及其制备方法，该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，具体技术方案如下。

一种抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）成曲酶的制备：将10～30g麸皮，5～20g花生粕，0.01～0.1g氯化钙和15～50g去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100～121℃下杀菌15～30min，冷却至38℃，接种米曲霉,在培养箱28～32℃培养48～72h；加入200mL去离子水，在30～50℃水浴中搅拌1～3h，在0～4℃下5000～10,000 × g离心20～30min，取上清液，冷冻干燥得成曲酶。

（2）花生粕酶解物的制备：将花生粕与水按质量比1：4～1：8混合，加入以花生粕蛋白质量计0.4～1%的成曲酶，在50～55℃酶解4～24h；85～95℃下灭酶15～30min，离心，取上清液，得到花生粕酶解液；

（3）抗氧化肽的分离纯化：将花生粕酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；再用凝胶过滤色谱柱G-15进行分离纯化，用去离子水以0.6～2 ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，然后冷冻干燥成粉末；

（4）最后用反相高效液相色谱法进一步纯化，色谱柱为XBridge^TM pre C18 柱(5μm, 10×150mm; Waters, USA)，流动相为A相和B相，洗脱程序为：0-4min内采用的流动相中A与B体积比为5:95-10:90, 4-8min内采用的流动相中A与B体积比为10:90-30:70，8-12min内采用的流动相中A与B体积比为30:70-50:50，12-30min内采用的流动相中A与B体积比为50:50，流速为2ml/min，检测波长为214nm。测定各组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分，冷冻干燥，得到目标肽。

所述A相为甲醇，B相为质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液。

用电喷雾串联质谱法测定肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，分子量为325.3Da。