[发明专利]具有pH敏感特性的抗酸纳米口服DNA抗肿瘤疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗，以及用其进行治疗方法。属于基因工程制药技术领域。

背景技术

乳腺癌已经成为女性中常见的一种肿瘤。根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)统计，2004-2008年间，确诊患有乳腺癌的患者平均年龄为61岁，女性中的年发病率约为0.0122％，其中亚裔/太平洋岛裔发病率约为0.0937％；2003-2007年间，乳腺癌患者平均死亡年龄为68岁，女性中的年死亡率为0.024％，其中亚裔/太平洋岛裔的年死亡率为0.0122％；其发病率和死亡率分别在女性中占第一和第二位。目前对乳腺癌的治疗主要是传统疗法，即手术切除、放疗和化疗。随着基础研究的发展和进步，更多的新型疗法正在不断涌现，例如免疫疗法和分子靶向疗法。免疫疗法包括制备肿瘤疫苗和使用免疫调节剂。分子靶向疗法主要以表皮生长因子受体和肿瘤新生血管生成为靶标。但是总体而言，无论是传统疗法还是新型免疫疗法，目前的治疗效果都不甚理想，这也是乳腺癌治愈率始终很低的主要原因，所以目前的疗法还有很大的改进空间。找到一种能够靶向多发的肿瘤病灶部位的载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对周围的正常组织造成影响将显著提高治疗效果，减低副作用。DNA疫苗能引起强而持久的细胞免疫及体液免疫。它能诱导CD8⁺T细胞的CTL反应及CD4⁺T细胞的Th1反应，并能激活B细胞产生中和抗体。DNA疫苗即可用于预防，亦可用于治疗，目前主要应用于感染性疾病、变态反应及肿瘤的防治。抗肿瘤DNA疫苗由于其具有如下优点：(1)产生免疫专一性好；(2)导入的质粒在体内可持续表达2个月；(3)构建双基因表达质粒可提高疫苗的免疫作用，使得DNA疫苗在各方面有了很大的发展。

壳聚糖是一种由甲壳素脱乙酰反应后的产品，分子量和聚合程度有关，不同分子量的壳聚糖制成的纳米颗粒进入体内会在不同的器官或组织富集，因此可以根据壳聚糖的这一特性有针对性的合成壳聚糖分子，使其特异性的将所负载的DNA或RNA运送的特定的器官或组织，如果再在壳聚糖纳米微球表明标记上组织特异性蛋白的配体或抗体，其靶向功能更佳。因此我们认为，以壳聚糖为微球骨架制成的纳米颗粒是良好的DNA疫苗载体，但由于壳聚糖分子链上游离的氨基会吸收大量的胃酸中的H+，成为一种溶胀结构，从而使携带的DNA片段遭到胃酸的降解，降低DNA疫苗的稳定性。这个问题是导致壳聚糖纳米DNA载体一直难以用于口服的重要影响因素。

目前绝大多数纳米颗粒都无法经受消化道特别是胃中的胃酸的消化作用，对其中被包裹的药物或者基因不能起到保护作用，因而无法通过口服途径进入人体发挥作用，给患者使用带来极大的不便。

发明内容

本发明的目的在于解决目前应用于试验性肿瘤免疫治疗的纳米颗粒载体毒副作用大、口服给药途径不稳定、表达效率低难以携带DNA通过胃酸环境并进入肠道高效表达肿瘤抗原的问题，提供一种新的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗。

本发明提供的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗，是通过利用海藻酸对壳聚糖纳米颗粒进行修饰，使壳聚糖纳米颗粒具有pH敏感性，然后将编码肿瘤特异性抗原Legumain蛋白的DNA质粒装载到修饰后的壳聚糖纳米颗粒而制成；该疫苗能够在口服给药后激活宿主自身的免疫应答，对肿瘤细胞进行杀伤；在疫苗通过胃液时保护DNA质粒不被降解，并在肠道中形成松散的结构，利于树突细胞及巨噬细胞吞噬，高效表达编码的基因；同时有效激发CD8⁺T细胞介导的免疫反应，降低调节T细胞对免疫系统的抑制作用，对肿瘤细胞进行杀伤，延缓肿瘤细胞的生长与转移。

本发明同时提供了一种具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备方法，具体步骤为：

第1、壳聚糖纳米颗粒的制备

第1.1、将分子量在28000至32000的长链壳聚糖溶解于双蒸水中，并调节pH值到5.2，在55℃下搅拌30分钟，形成A液；

第1.2、同时将25mM Na₂SO₄溶液与DNA质粒混合加热至55℃，匀速搅拌30分钟，形成B液；

第1.3、随后将A液与B液以体积比1∶1混合两种溶液，并马上进行混合，5分钟后将制备好的壳聚糖纳米颗粒保存在4℃；

第2、海藻酸侧链上的羧基的活化