[发明专利]一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。

背景技术

豆酱发酵过程中真菌种类繁多，这些真菌对豆酱发酵产生很大影响，可以改变豆酱发酵速度和产品风味，甚至会导致发酵失败。摸清豆酱发酵过程中真菌的多样性，对于实现豆酱工业化生产具有重要意义。但是现有对豆酱发酵过程中真菌种类及数量的研究中，多以传统分离培养方法，即形态鉴定结果为主，传统的活菌计数方法局限于可培养的微生物，而很多微生物是不可培养的，因此丢失了许多不可培养微生物的信息。另外，传统分离培养方法工作量大，在对微生物菌群进行培养时，主观性比较强，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，即人为改变了原始菌群的菌群构成，对研究结果造成的偏差较大。这就给客观认识微生物的存在状况造成了严重地障碍。

发明内容

本发明是要解决传统的检测豆酱发酵过程中真菌多样性的方法工作量大，检测结果不准确的问题，提供一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。

本发明检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行：一、称取10g豆酱样品，加入到50mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min，然后于200r/min离心5min，收集上清液；二、将沉淀用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，然后于200r/min离心5min，收集上清液，重复此步骤3次；三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/min离心12min，弃上清，收集沉淀X，将沉淀X用5mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮，振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA；五、以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；六、将产物A稀释100倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；七、以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，凝胶变性梯度范围为40％～70％，电泳电压为130V，电泳时间为6h，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次PCR扩增所用上游引物nu-SSU-0817序列为5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’，下游引物nu-SSU-1536序列为5’-ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’；步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物nu-SSU-0817序列为5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’，下游引物nu-SSU-1196序列为5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。

本发明的优点：

待检测的豆酱样品不仅含有微生物细胞，还含有多种有机物质和无机盐，这些杂质会对DNA后续分析产生巨大影响。因此本发明采用间接法提取豆酱样品中总DNA，即先经过梯度离心、洗涤等步骤去除豆酱样品中的杂质，然后再收集细胞并裂解细胞。这种对样品预处理的方法所提取的总DNA的量具有较好的稳定性。

本发明方法可以将不可培养微生物及数量极少的微生物都检测出来，使检测结果更加准确。可以在无需对菌种培养分离的情况下，对成分复杂的发酵样品直接取样进行分析，使试验过程简单便捷。而且该方法的灵敏度高、可重复性和可靠性好，能全面的反应菌群结构多样性。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。