[发明专利]一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法

权利要求书

1.一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行：一、称取10g豆酱样品，加入到50mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min，然后于200r/min离心5min，收集上清液；二、将沉淀用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，然后于200r/min离心5min，收集上清液，重复此步骤3次；三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/min离心12min，弃上清，收集沉淀X，将沉淀X用5mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮，振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA；五、以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；六、将产物A稀释100倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；七、以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，凝胶变性梯度范围为40％～70％，电泳电压为130V，电泳时间为6h，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次PCR扩增所用上游引物nu-SSU-0817序列为5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’，下游引物nu-SSU-1536序列为5’-ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’；步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物nu-SSU-0817序列为5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’，下游引物nu-SSU-1196序列为5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于步骤三中将沉淀X用5mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤的方法具体为：向沉淀X中加入5mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，然后用移液器吹打至悬浮，于9000r/min离心10min。

3.根据权利要求1所述的一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于步骤五中第一次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。

4.根据权利要求1所述的一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于步骤六中第二次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。