[发明专利]甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒及其检测方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及甘薯上的马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G，SPVG）和甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic virus，SPVMV)是危害甘薯的主要病毒，4种病毒都属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），4种病毒或与其他病毒常常混合侵染甘薯，造成甘薯产量降低，品质变劣和种性退化，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用茎尖分生组织培养，培育脱毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在脱毒甘薯的培养和脱毒种薯（苗）实现产业化过程中，病毒的快速检测技术是保证脱毒种薯质量以及实现脱毒种薯产业化非常关键的技术。只有利用快速、高效的病毒检测技术，筛选出真正无毒的试管苗并及时淘汰不同级别的感病种苗，才能使真正的脱毒种薯用于生产，确保脱毒种薯的增产效果，进而加快脱毒种薯的推广进程。因此，建立甘薯病毒高效的检测技术是培育脱毒甘薯的前提和基础。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附（ELISA）技术，以及在此基础上建立的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）技术。由于侵染甘薯的Potyviruses病毒种类较多，当不需要确定病毒种类，只需要确定样品中是否含有Potyviruses病毒时（譬如对甘薯脱毒茎尖苗进行检测），利用上述方法进行检测时需要对各种病毒逐一进行检测，往往费时费力，造成浪费。

发明内容

    本发明要解决的技术问题：克服背景技术中的问题，提供一种简便、高效和低成本的检测甘薯上四种马铃薯Y病毒属病毒的试剂盒；

另外还提供了这种试剂盒的检测方法。

本发明的技术方案：

甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，所述试剂盒分为上、下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放置有硝酸纤维素膜；不同试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和Tris-HCl溶液。

所述试剂瓶为九个，其中一号试剂瓶装有甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶装有甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶装有甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶装有甘薯脉花叶病毒SPVMV抗体，五号试剂瓶装有上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶装有工作浓度为1：1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG，七号试剂瓶装有浓度为50mg/ml的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶装有浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP，九号试剂瓶9装有pH为7.5的2M Tris-HCl溶液。

所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体均是利用大肠杆菌中表达的病毒外壳蛋白，通过纯化蛋白、免疫家兔的方法制备获得，所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体和混合抗体的效价均为4096倍，工作浓度为1：1000倍。

甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）准备硝酸纤维素NC膜：剪取合适大小的NC膜，用铅笔在膜上做好标记，以便于点样；

（2）样品处理：将0.1g甘薯样品于液氮中速冻，并研磨成粉末，加入100μl抽提缓冲液，继续研磨至彻底裂解并转移到离心管中，5000rpm离心5min；

（3）点样：将NC膜置于TBS中浸泡1 min，用滤纸吸去膜表面的液体，取上清液5μl点于膜上，室温晾干；

（4）封闭：加入10ml封闭液于培养皿中，将膜浸入其中，室温孵育60 min；

（5）洗膜：弃去封闭液，用TBS 洗膜一次；

（6）加一抗：将NC膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗体中，室温下以50rpm/min的速度振荡，孵育过夜；

（7）洗膜：弃一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；