[发明专利]甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒分为上、下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放置有硝酸纤维素膜；不同试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和Tris-HCl溶液。

2.如权利要求1所述的血清学检测试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶为九个，其中一号试剂瓶装有甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶装有甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶装有甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶装有甘薯脉花叶病毒SPVMV抗体，五号试剂瓶装有上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶装有工作浓度为1：1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG，七号试剂瓶装有浓度为50mg/ml的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶装有浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP，九号试剂瓶9装有pH为7.5的2M Tris-HCl溶液。

3.如权利要求1-3任一项所述的血清学检测试剂盒，其特征在于，所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体均是利用大肠杆菌中表达的病毒外壳蛋白，通过纯化蛋白、免疫家兔的方法制备获得，所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体和混合抗体的效价均为4096倍，工作浓度为1：1000倍。

4.甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

（1）准备硝酸纤维素NC膜：剪取合适大小的NC膜，用铅笔在膜上做好标记，以便于点样；

（2）样品处理：将0.1g甘薯样品于液氮中速冻，并研磨成粉末，加入100μl抽提缓冲液，继续研磨至彻底裂解并转移到离心管中，5000rpm离心5min；

（3）点样：将NC膜置于TBS中浸泡1 min，用滤纸吸去膜表面的液体，取上清液5μl点于膜上，室温晾干；

（4）封闭：加入10ml封闭液于培养皿中，将膜浸入其中，室温孵育60 min；

（5）洗膜：弃去封闭液，用TBS 洗膜一次；

（6）加一抗：将NC膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗体中，室温下以50rpm/min的速度振荡，孵育过夜；

（7）洗膜：弃一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；

（8）加二抗：用滤纸吸去NC膜上多余的溶液，然后将NC膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下以50rpm/min的速度振荡，孵育1 h；

（9）洗膜：弃二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；

（10）显色：将NC膜置于NBT和BCIP的底物溶液中，每5ml底物缓冲液先加入33μl NBT，再加入16.5μl BCIP，室温下以50 rpm/min的速度摇床振荡，避光显色5-30 min；

(11) 终止反应：将NC膜从底物溶液中取出，用蒸馏水洗NC膜3次，3-4min/次；

（12）阳性判断：将NC膜晾干后观察颜色反应，比较检测样品与正负对照的颜色反应，出现紫色的样品为阳性。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述抽提缓冲液为TBS和0.2%亚硫酸钠的混合液。

6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述封闭液的成分为TBS、2%脱脂奶粉和2%聚乙二醇辛基苯基醚的混合物。

7.如权利要求4-6任一项所述的检测方法，其特征在于：所述工作浓度的抗体为SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV抗体或混合抗体，抗体工作浓度均为1：1000倍。

8.如权利要求4-6任一项所述的检测方法，其特征在于：所述酶标抗体为碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG抗体，酶标抗体的工作浓度为1：1000倍。