[发明专利]利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法

权利要求书

1.一种利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法，其特征在于，将植物乳杆菌接种于含有除烟酸和烟酰胺外的植物乳杆菌生长所用的培养基中，则植物乳杆菌的生长量与所加入的烟酸和烟酰胺标准品的含量相对应，并绘制标准曲线；然后对饲料样品进行水解处理，制备待测样品溶液，将等量的植物乳杆菌接种于含有待测样品溶液的培养基中，从而根据植物乳杆菌的生长量定量计算出饲料样品中烟酸和烟酰胺的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)烟酸和烟酰胺标准溶液的配制：精确称取烟酸标准品，用乙醇配制成已知浓度的溶液，向含有除烟酸和烟酰胺外的植物乳杆菌生长所用的培养基中加入该烟酸的乙醇溶液，配制成烟酸终浓度为0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45和50ng/mL的标准溶液；

2)烟酸和烟酰胺标准曲线的绘制：将定量的植物乳杆菌分别接种于上述不同烟酸浓度的标准溶液中，根据植物乳杆菌的生长量与烟酸标准品的含量绘制标准曲线；

3)饲料样品的水解处理：将饲料样品溶解于1mol/L硫酸溶液中，超声后灭菌，用NaOH调节pH值6.0-6.5，然后用盐酸调节pH值4.5，将水解液转移至容量瓶中定容，得到待测样品溶液；

4)饲料样品中烟酸和烟酰胺含量的测定：将等量的植物乳杆菌接种于含有待测样品溶液的培养基中，根据植物乳杆菌的生长量定量计算出饲料样品中烟酸和烟酰胺的含量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，接种所用的植物乳杆菌为菌液形式，其制备过程如下：

1)菌种的活化：将植物乳杆菌ATCC 8014冻干粉加入盛有MRS肉汤培养基的厌氧管中，置于37±1℃培养箱中培养，首次培养48h，以后每24h传代一次，传代10次后用穿刺法转接于MRS琼脂培养基中，-20℃保存，每周转接一次；

2)菌液的制备：将转接于MRS肉汤培养基中的菌液倒入10mL离心管中，2000转/分离心10min，弃去上清液，加入10ml 0.9％生理盐水，震荡混匀如前离心，反复两次，再加入10ml生理盐水制成菌悬液，以生理盐水为对照，用分光光度计于550nm波长下测定其透光率，透光率为60～80％的菌液为接种时使用的菌液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS肉汤培养基为：葡萄糖30g、胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.3g、四水硫酸锰0.12g、吐温801mL和水1000mL，pH6.7±0.2；所述MRS琼脂培养基为：向上述MRS肉汤培养基中按1.5％～1.8％的重量比添加琼脂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述饲料为天然饲料或动物全价料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述动物全价料为鸡、鸭、猪、牛、羊全价料。