[发明专利]一种用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及金属离子检测领域，具体涉及一种用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器及其制备方法。

背景技术

目前国内外检测铅离子的方法主要有光谱分析法、电化学分析法、质谱分析法等。

光谱分析法包括了可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、原子发射光谱法等。可见分光光度法灵敏度低、选择性不高，并且需要使用剧毒物质和具有挥发性的有机溶剂，对实验人员有潜在的伤害，限制了该方法的应用。火焰原子吸收光谱中和石墨炉原子吸收光谱的实验条件相对复杂，需要用到大型的仪器，前者的检测灵敏度相对较低，后者虽然具有较高的灵敏度，但容易受到其他共存杂质的干扰，影响测定的准确性。原子荧光光谱法利用铅离子与合适还原剂如硼氢化钠反应时，可形成气态氢化物，原子化后可进行荧光测定的原理进行检测。此方法虽然在灵敏度和抗干扰程度方面都优于石墨炉原子吸收光谱法，但仍然需要仪器的使用。

电化学方法有试剂用量少，操作灵敏可靠、快速、相对简单，易于推广普及等优点。常见的电化学检测方法有：极谱法、阳极溶出伏安法、电位溶出法等。但传统的电化学方法一般使用汞膜电极或汞溶液来测定，容易污染环境，对操作人员健康造成危害。使该方法也受到了应用方面的限制。同时，近年来，利用筛选出来的铅离子特异性的酶作为基础用来检测的方法也层出不穷，Zhu等以钌联吡啶衍生物标记DNAzyme构建了抑制型铅离子电化学发光传感器。马等以DNAzyme为分子识别物质，铅离子为分析对象，钌联吡啶衍生物为电化学发光标记物，设计了基于铅离子的“8-17”DNAzyme催化的电化学发光检测铅离子的生物传感器。

质谱分析法：质谱是一种常见的用于检测的仪器，虽然质谱仪具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，可以实现多组分分析的特点，但仪器比较昂贵，使用及维修比较困难。大部分地区都没有此仪器，在实际应用方面有一定难度。

胶体金颗粒是近年来出现的一种新型纳米材料，是最稳定的纳米金粒子，因其独特的特性迅速的应用于各个领域，包括用于催化反应，光学材料，电子器件，生物传感器，药物载体和高对比度的细胞成像等。研究表明，纳米金溶液的颜色与纳米金颗粒的间距以及纳米金聚集体的大小有关。纳米金颗粒的间距若明显超过其平均直径，纳米金呈分散状态，宏观上表现为红色；该间距若小于平均直径，则纳米金易团聚，呈聚集态，宏观上表现为紫色到蓝色。利用纳米金的这种性质，可设计一系列生化反应以改变纳米金颗粒间的距离，从而实现对靶物质的检测。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的铅离子检测技术中存在的不足，提供一种可以快速检测铅离子的核酸纳米金生物传感器，利用铅离子存在时，特异的核酸酶能够切断与其互补的底物这一原理，并利用免疫胶体金作为放大显色系统，用于检测铅离子的存在。

本发明另一目的在于提供上述核酸纳米金生物传感器的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述核酸纳米金生物传感器的使用方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

铅离子检测研究的原理：

2003年，Brown等筛选出了一种依赖Pb²⁺特异性的核酸酶，命名为8-17核酸酶。在此研究中，我们选取了此核酸酶的原始序列和底物序列。

在已有Pb²⁺依赖酶活性DNAzyme的基础上，具体设计合成以下六段序列：

第一段为铅离子特异性的核酸酶序列，含有36个碱基(如SEQ ID NO:1所示)；

第二段为与核酸酶互补的底物序列，包含26个碱基(如SEQ ID NO:2所示)，3'端与酶完全互补，5’端比酶序列稍长，互补序列含有一个脱氧核糖核苷酸A，它是酶活性的关键部位；

第三段序列为竞争序列，用于胶体金标记，序列为（5’-SH-SEQ ID NO:3-3’），它的5’端用巯基修饰，标记在胶体金颗粒上，其序列与第二段底物序列相同，与底物序列竞争性的和检测线上标记的核酸结合；

第四段序列划在检测线上，序列为（5’- biotin-SEQ ID NO:4-3’），这段序列与核酸酶的底物以及竞争序列完全互补；

第五段和第六段均为质控序列。一个标记在胶体金上，序列为（如5’-SH-SEQ ID NO:5所示），一个划在质控线上，序列为（5’-biotin- SEQ ID NO:6-3’），他们互相互补配对，用于检测生物传感器的稳定性（图1）。