[发明专利]一种用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线；所述检测线是用链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:4序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；所述质控线是链霉亲和素和标记有生物素的SEQ ID NO:5序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成的；所述金标垫上喷有胶体金；胶体金结合有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的序列。

2.权利要求1所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于将硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维和样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽为4mm的核酸纳米金生物传感器。

3.根据权利要求2所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述胶体金溶液的制备方法是将100g、0.01%的HAuCL₄溶液搅拌加热到沸腾，然后加入4ml、1%的柠檬酸三钠，溶液变为红色后，继续煮沸10min，停止加热，继续搅拌至冷却；然后将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的序列按照一定的摩尔比混合后，用去离子水溶解，加入到1-10倍体积浓缩的胶体金溶液中，混合标记1-48h，再用牛血清白蛋白或PEG封闭多余的活性位点，加NaCl和SDS，分别至终浓度为0.1-0.15M和0.01%-0.1%，老化后，8000~16000rpm离心20~60min，弃上清，重悬沉淀，即得到金标核酸。

4.根据权利要求2所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述样品垫是玻璃纤维浸泡含有表面活性剂、电中性或碱性缓冲液（磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris缓冲液、Hepes缓冲液等）、PEG4000、BSA和蔗糖的混合溶液后，37℃烘干备用。

5.根据权利要求2所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述金标垫是将金标核酸涂于玻璃纤维上，37℃干燥30min~3h，制成金标垫。

6.根据权利要求2所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述硝酸纤维素膜上的质控线是用去离子水溶解核酸序列SEQ ID NO:6，再取一定体积的核酸序列SEQ ID NO:6，加入链和亲霉素，室温反应30min~3h，涂于硝酸纤维素膜上，37℃干燥，得到质控线。

7.根据权利要求2所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述硝酸纤维素膜上的检测线是用去离子水溶解核酸序列SEQ ID NO:4，再取一定体积的核酸序列SEQ ID NO:4，加入链和亲霉素，室温反应30min~3h，涂于硝酸纤维素膜上，37℃干燥，得到检测线。

8.权利要求1所述用于检测铅离子的核酸纳米金生物传感器的使用方法，其特征在于所述方法是将核酸酶（SEQ ID NO:1）和底物（SEQ ID NO:2）以一定比例混合，游离的底物与胶体金上标记的核酸竞争性的结合检测线上的核酸序列，封闭检测线上的结合位点，将待测样品加入其中反应；如果待测样品中含有铅离子，则核酸酶会切断与其互补的底物序列，游离的底物序列会减少，从而降低其封闭性，胶体金颗粒上标记的核酸序列与检测线上的核酸序列发生反应，胶体金颗粒停留在检测线上，从而使得检测线显红色；胶体金颗粒继续往前经过质控线，胶体金上标记的第五段核酸序列与质控线上的核酸序列发生互补配对反应，使得质控线显红色，为阳性结果；如果待测样品中没有铅离子，则核酸酶不会切断其互补的底物序列，上样后，由于检测线上的核酸完全被游离的底物序列所封闭，则不会与胶体金颗粒上标记的序列发生反应，检测线不显色，但胶体金颗粒上标记的序列仍然能与质控线上的序列发生反应，质控线显红色，为阴性结果；如果质控线不显色，不管检测线显色与否，都说明生物传感器本身出现了问题，结果不可信，为无效结果。