[发明专利]全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法

说明书

技术领域

本发明属于第二代基因测序技术领域，具体涉及一种全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法。 

背景技术

表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的可遗传的表型变化的学科。表观遗传学修饰主要有DNA甲基化/羟甲基化、组蛋白共价修饰、非编码RNA等。表观遗传学修饰在胚胎发育、细胞分化、X染色体失活、基因印记等方面发挥重要作用，表观遗传修饰异常与很多疾病相关（Feinberg AP. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature 2007; 447: 433-40. Ballestar E. Epigenetic alterations in autoimmune rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol 2011;7:263-71.），具有重要的研究意义。全基因组范围检测生物样本中表观遗传修饰的差异是一种重要的研究手段，可以无偏差的获得大量信息，对于研究发育分化与疾病发生机制具有重要意义。 

2005年以前，全基因组范围的表观遗传学研究手段主要依靠DNA芯片（如：ChIP-on-chip）。2001年，由美、英、法、德、日、中六国合作的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成（ Initial sequencing and analysis of the human genome. Lander ES, et al.. Nature. 2001 Feb 15;409(6822):860-921. ），此后各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，2006年，美国X大奖基金会（www.xprize.org）设立Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队，从而加速第二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）的出现。2005年罗氏（Roche）（Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Margulies M, et al. Nature. 2005 Sep 15;437(7057):376-80.）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）（Universal ligation-detection-reaction microarray applied for compost microbes. Hultman J, et al.. BMC Microbiol. 2008 Dec 30;8:237.）、Illumina（Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Bentley DR, et al.. Nature. 2008 Nov 6;456(7218):53-9.）三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。基于焦磷酸测序原理的454测序系统（Roche）因其在读长方面的优势，因而在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。基于寡聚物连接检测的测序系统（ABI）准确率高、对于高GC含量的样本有非常大的优势。Illumina的测序系统基于DNA簇（DNA cluster）、桥式PCR（Bridge PCR）和可逆阻断（Reversible terminator）等核心技术以应用范围广泛著称，在功能基因组方面的应用占据优势。 

DNA甲基化或羟甲基化修饰参与了多个生物过程的调节，成为目前研究的热点。DNA甲基化检测的方法有很多种，目前直接检测甲基化的方法有薄层层析、HPLC、质谱、单分子实时（SMRT）测序技术等，但每次检测的通量和范围有限。全基因组范围检测DNA甲基化修饰主要有三种方法：（1）亚硫酸盐处理后高通量测序；（2）特异性抗体或甲基化DNA结合蛋白亲和富集5mC后高通量测序或启动子芯片分析；（3）甲基化DNA特异性酶切后高通量测序。亚硫酸氢盐转化存在转化不完全（亚硫酸氢盐转化是将序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变）、数据通量要求大、操作繁琐、费钱费力等缺点。最近的研究还表明亚硫酸盐转化与甲基化特异性酶切技术不能区分5mC与5hmC。已有的全基因组范围检测DNA甲基化或羟甲基化修饰的方法仅适用于定性分析，并不适用于定量分析。