[发明专利]全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法

权利要求书

1.一种全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法，其特征在于采用标签法，对多个待测样品分别加上特异性的序列标签，即Barcode；然后将这些样品混合在一起进行羟甲基化DNA片段免疫沉淀，从而实现全基因组范围内基因组DNA修饰的定量测序；所述DNA修饰为5-羟甲基胞嘧啶即5hmC修饰，5-甲基化胞嘧啶即5mC修饰，5-羧基胞嘧啶即5caC修饰，或5-甲酰胞嘧啶即5fC修饰；

其中所用的接头及特异性的序列标签如下所示：

ESC Barcode: CCAG*

接头序列：

5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAG*T 3'

3'GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGAGGTC*5'

NPC Barcode: TAGC*

接头序列：

5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGC* T3'

3'GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGAATCG*5'

MEF Barcode: GCTA*

接头序列：

5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GCTA*T3'

3'GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGACGAT*5' 。

2.根据权利要求1所述的全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法，其特征在于具体操作步骤为：

（1） 基因组DNA的抽提

    使用常规方法抽取基因组DNA，使DNA相对完整，OD260/280≈1.8；

（2） Barcode样品制备

精确定量基因组DNA，分别取等量的基因组DNA，相同条件下进行超声处理，将基因组DNA片段化至200-800bp；对经超声处理的DNA片段进行末端补平，末端加A，用加了Barcode的接头序列进行连接反应，纯化好的产物用作接下来的相应修饰的DNA片段的免疫沉淀实验；

（3）相应修饰的DNA片段免疫沉淀实验及特异性产物PCR扩增   

将加好接头的基因组DNA充分混合变性为单链，然后进行相应修饰的DNA片段的免疫沉淀反应；相应修饰的DNA片段免疫沉淀反应之后分别对免疫共沉淀产物及免疫共沉淀前基因组DNA混合物进行纯化，得到的纯化后的DNA用于接下来的PCR富集反应；

（4）测序

按操作流程在illumina cluster generation 及GA‖上进行测序。

3.根据权利要求2所述的全基因组范围的DNA修饰定量测序方法，其特征在于所述Barcode序列长短根据样品个数进行改变，Barcode碱基序列可随意排列组合。