[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用

说明书

技术领域

一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产γ-氨基丁酸上的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种在中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，如降血压、保持神经安定、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、保肝利肾等。近年来，GABA的研究和应用受到了广泛的关注。目前，国内外主要采用化学合成法和微生物法制备GABA，化学合成法反应条件剧烈，污染严重；微生物发酵法条件温和、安全、成本较低，但后处理过程复杂且生产周期长；全细胞转化法合成GABA则可提高底物转化率和产品纯度，且具有节约后处理工序、缩短生产周期及降低环境污染等优点，越来越受到国内外研究者的广泛重视。

本发明课题组专利“一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育”公开号：101928679A公开日：2010.12.29，该专利公开了以植物乳杆菌(LP-GB 01-21)为生产菌株，5L发酵罐水平，在pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲液中进行全细胞转化，最终GABA浓度达到132g/L，摩尔转化率为94.3％，产量明显高于其他同类菌株，但由于植物乳杆菌是兼性厌氧微生物，培养条件较难控制，GABA的生产效率受培养条件影响较为显著；同时，植物乳杆菌中GAD的表达量受菌体代谢状态的控制，表达量有限，全细胞转化效率仍有待于提高。鉴于此，本研究拟通过构建GAD高表达型重组大肠杆菌，借助大肠杆菌生长迅速、易于高密度培养和GAD表达可以人工调控的优点进行GABA大规模和高效率生产。另外，GAD是生物催化L-谷氨酸脱羧反应生成γ-氨基丁酸的限速酶，通过对该酶的酶学性质进行研究，即酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH与酶活性的关系，几种金属离子对酶的影响，来确定该酶作用的合适条件指导全细胞转化法合成GABA，并为工业化制备GABA提供了参考依据。

发明内容

本发明的目的在于提供：一种高产GABA重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法，并对重组谷氨酸脱羧酶(GAD)酶学性质进行研究，根据酶学性质的研究结果确定了最优转化条件，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。

本发明的技术方案：提取总Lactobacillus plantarum染色体为模板，根据GeneBank公布的植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因组序列设计引物如下：

P1：5’-GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’；(下划线为BamH I酶切位点)

P2：5’GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3’(下划线为Not I酶切位点)进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃，5min预变性；94℃50s，57℃1min 30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。所得片段经胶回收后与克隆载体pMDl8-T连接，转化E.coli JMl09，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-Lpgad，采用相同限制性内切酶分别对T-lpgad和pET-28a(+)进行双酶切，胶回收lpgad片段，将其与线性化载体pET-28a(+)混合，在T4连接酶的作用下过夜连接，再转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，将符合预期结果的阳性转化子于-80℃冰箱中保藏。

取冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日转接LB培养基中，IPTG诱导表达，粗酶液采用比色法进行酶活测定，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟产生1μmol GABA所需的酶量，粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。粗酶液经Ni-NTA纯化得到重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究。

通过对重组谷氨酸脱羧酶GAD酶学性质的初步研究，确定了其最适作用温度、最适pH以及具有较强促进作用的金属离子种类及浓度，根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，5L发酵罐水平，对重组菌进行转化产GABA实验。