[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用

权利要求书

1.本专利构建一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸诱导型重组大肠杆菌，并对高表达谷氨酸脱羧酶酶学性质进行研究并应用于重组菌转化γ-氨基丁酸条件的优化，其特征是首次扩增了经多次诱变筛选获得的具有较高谷氨酸脱羧酶活性的植物乳杆菌GB 01-21(保藏号CCTCC M 209102)的谷氨酸脱羧酶编码基因lpgad，构建高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad。最终重组菌转化液中产物GABA浓度为204.5g/L，转化率为97.92％。

2.根据权利要求1所述高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法，其特征是：以植物乳杆菌GB 01-21全基因组为模板，设计一对引物PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因lpgad，构建重组质粒pET-28a-lpgad。

根据GeneBank公布的植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因组序列设计引物如下：

P1：5’-GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’；(下划线为BamH I酶切位点)

P2：5’-GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3’(下划线为Not I酶切位点)提取植物乳杆菌GB 01-21染色体为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃，5min预变性；94℃50s，57℃1min 30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。所得片段经胶回收后与克隆载体pMDl8-T连接，转化E.coli JMl09，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-Lpgad，采用相同限制性内切酶分别对T-lpgad和pET-28a(+)进行双酶切，胶回收lpgad片段，将其与线性化载体pET-28a(+)混合，在T4连接酶的作用下过夜连接，构建重组质粒pET-28a-lpgad。

3.根据权利要求1所述，该重组大肠杆菌的基因表达产物经镍柱纯化后获得重组谷氨酸脱羧酶，大小为53kDa。

4.根据权利要求1和3所述，重组谷氨酸脱羧酶酶学性质特征在于：最适pH为4.8，在pH3.6-5.2范围内稳定性较好；最适温度为37℃，20℃-40℃范围内，保温10h，相对酶活仍在85％以上；2.5mmol/L Ca²⁺时激活作用最明显，相对酶活达154％，3.5mmol/L Mg²⁺对重组酶GAD的激活作用最强，酶活达131％；Km为9.21mmol/L，Vmax为7.58mmol/L。

5.根据权利要求1所述酶学性质在指导转化条件优化上的应用，其特征是：根据酶学性质的研究结果，将转化体系的温度、pH分别调整至最适值，并向其中添加对重组酶GAD具有促进作用的金属离子，来确定最优转化条件。

(1)重组菌摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl 0.3，K₂HPO₄0.1，MgSO₄7H₂O 0.05。在pH 6.5～7.0、121℃下灭菌10min。

重组菌发酵培养基(g/L)：葡萄糖5.0，蛋白胨10，玉米浆7.5，NaCl 0.5，K₂HPO₄0.1，MgSO₄7H₂O 0.05，L-谷氨酸1.0，生物素2×10^-5。pH 6.5～7.0、121℃下灭菌10min。

(2)培养条件：将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml)LB培养基中，于旋转式摇床中37℃、160r/min培养12h进行活化，再以5％的接种量接入500ml摇瓶(装液量为100ml)种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液，按10％的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先于37℃、250r/min培养至OD₆₀₀为0.6，再向其中添加乳糖至终浓度为1g/L，同时在线控制pH6.8流加葡萄糖，30℃，诱导发酵14h至OD₆₀₀为13.6。

(3)5L发酵罐重组菌全细胞转化条件为：pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液、2.5mmol/L Ca²⁺、3.5mmol/L Mg²⁺，转化温度37℃、250r/min。

(4)在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每3h投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，12h后，投料时间间隔延长到6h，在转速250r/min、通气量1vvm的条件下转化24h，反应结束后转化液离心取上清，加入15％的三氯乙酸终止反应，取1ml进行适当稀释后，氨基酸自动分测得转化液中产物GABA浓度为204.5g/L，转化率为97.92％。