[发明专利]一种抗菌肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工合成的全新抗菌肽及其制备方法。

背景技术

抗生素由于产生药物残留及细菌耐药性问题，因此迫切需要发现一种绿色、无污染和无细菌耐药性的替代物。抗菌肽是生物体内广泛存在的一种具有广谱抗菌活性的小肽类物质，是生物非特异性防御系统的重要组成部分，能够抑制多种细菌或真菌，甚至包括肿瘤细胞在内的生长。抗菌肽由于带有净正电荷，从而通过物理作用与细菌胞膜产生物理作用；再通过疏水性残基与磷脂中的疏水组分相互作用而抑制或者杀死细菌。而对于细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构，因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。

抗菌肽的种类、数量繁多，结构也是复杂多变的。因此很难找到统一的抗菌肽模型来进行广泛的研究。另外，盲目使用基因工程的方法表达抗菌肽，而没有对抗菌肽的结构和功能以及体内外活性进行全面的探讨，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性和细胞毒性。目前为止，已经有很多种方法来研究抗菌肽的结构和功能之间的关系。比如通过自然存在的天然抗菌肽的氨基酸替换或删减来产生一系列衍生物，或通过构建抗菌肽库的方法筛选抗菌肽，或利用最简化的方法来得到仅含有几种氨基酸的全新抗菌肽等方法。因此，本发明从抗菌肽的作用机制及其氨基酸组成特点入手来合成一组抗菌肽。通过使用碱性氨基酸精氨酸(Arg)残基来提供正电荷来吸引细菌表面的负电荷，再通过由脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)与磷脂发生疏水性作用，从而产生生物学活性，为抗菌肽作用机制的研究及其应用提供支持。国内外还未见到利用精氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸作为结构单元来研究抗菌肽结构与功能关系的报道和研究。

发明内容

本发明是为了得到抗菌活性较高而细胞毒性相对较低的抗菌肽，从而设计并制备了一组抗菌肽，并最终筛选出抗菌肽B。

抗菌肽B的氨基酸序列是：IleTrpArgIlePheArgArgIlePhe

抗菌肽B的设计和制备方法如下：1)首先，根据抗菌肽的作用机理和氨基酸组成的特点，设计由带正电荷的氨基酸精氨酸(Arg)、脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)作为基本结构单元的一组氨基酸，即表1中的A-E五个抗菌肽；二、采用固相化学合成法，通过多肽合成仪来合成设计得到的多肽；三、将合成出来的多肽粗制品经过反相高效液相色谱进行纯化，并利用点喷射质谱进行鉴定后，即完成多肽的制备。

通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现抗菌肽B不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌和阴性菌都有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。综合来看，抗菌肽B的治疗指数最高，细胞选择性最佳，是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽A的质谱图。

图2为抗菌肽B的质谱图。

图3为抗菌肽C的质谱图。

图4为抗菌肽D的质谱图。

图5为抗菌肽E的质谱图。

具体实施方式

实施例1：

根据抗菌肽的作用机理和氨基酸组成的特点，通过使用碱性氨基酸精氨酸(Arg)残基来提供正电荷来吸引细菌表面的负电荷，而通过脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)与磷脂发生疏水性作用，从而通过使得抗菌肽能对细菌细胞膜产生破坏作用。依据此原理，本实施方式中共有五个抗菌肽，即表1中的A-E；

实施例2：

将上述五个多肽使用多肽合成仪进行合成，选用固相有机合成，合成方向从C端到N端逐一进行，采用Fmoc保护合成法，具体步骤为：

选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三酮检测剂检查A-Wang脱保护的质量。