[发明专利]微环基因载体及其制备方法和应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种微环基因载体及其制备方法和应用。

【背景技术】

基因治疗是治疗很多遗传性、获得性疾病最理想方法，目前已经有很多临床前实验成功的报道。然而，临床上成功的例子却鲜有报道。基因治疗的核心是将治疗载体送入靶细胞，但载体的构建和投送方面，还有若干技术问题有待解决。基因治疗载体可分为两类，即病毒载体和非病毒载体。病毒载体感染细胞的效率很高，但由于其免疫原性和插入性突变，容易引起严重的反应，包括致癌、致命，因而难以被临床接受；此外，制造成本高也是其应用的一大障碍。非病毒载体较安全、经济、转基因的大小无限制，相对于病毒载体具有一定的优势，但目前还缺乏送入体内细胞的有效手段。

全球有超过全世界三亿五千万人，中国有超过一亿人，是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)携带者。HBV可诱发肝衰竭、肝硬化及肝癌，导致感染者过早死亡。现有的治疗药物，包括核苷酸类药物、干扰素等，疗效不能持久，需经常或每天给药，价格昂贵且副作用大，应用范围有很大限制。疫苗注射可有效预防乙肝病毒感染扩散产生新带毒者，但对己有带毒者无效。此外，疫苗注射覆盖不全，且有部份受注者不产生保护性免疫反应，故每年仍有大量新病例产生。市场需要一种高效、安全、价廉、方便的新治疗技术与产品。

下面通过基因载体表达干扰RNA(interference RNA，RNAi)，治疗HBV感染的研究现状，来说明基因治疗的巨大潜力和现有问题。

RNAi是最近发现的、生物细胞内的一种保守的分子机制，可将含有特定结构的双链RNA(dsRNA)，包括小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)加工成20～30碱基的RNA，形成RNA诱导的静默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过与靶mRNA淬火链合(annealing)，将其裂解或抑制其翻译，达到阻止蛋白质合成的目的。这是生物调节细胞反应过程、抵抗入侵病毒的普遍机制。科学家们正在做出巨大的努力，试图把这个机制转变成治疗技术，治疗各种疾病。已有很多成功的临床前实验的报道，包括抗癌、抗病毒感染等。目前已经有采用RNAi的方式，在体内、体外抑制HBV病毒复制，并且具有较好的效果的报道(McCaffrey，2003)。但该技术还存在一些问题，因而难以应用于临床，主要包括：合成的siRNA在肝细胞内的存留时间短，需反复给药，成本高；用质粒表达RNAi，在体外短期效果很好，但体内投递，效率不高，仅能到达少部分肝细胞，而HBV可存在于几乎所有的肝细胞，因而疗效不彰；标准质粒(plasmid)的骨架DNA成份(DNA复制起源，包括抗菌素抵抗基因等)，可抑制转基因表达，使质粒很快失去表达功能；病毒载体如AAV，肝细胞感染率很高，对HBV的抑制很完全(Li，2009)，但AAV载体可被宿主体内抗体中和失效，或诱发可致命的宿主免疫反应，同时病毒基因组插入性突变，潜藏着致癌的危险。因此，发展安全、高效的载体技术，是实现用RNAi治疗HBV感染的关键。

除了RNAi，反义RNA(antisense RNA)、诱饵RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)也有强效的抗HBV复制的效果。但它们与RNAi一样面临着载体的构筑和有效投送到靶细胞等问题。

Chen等发明的微环DNA(MC)技术(Chen，Z.Y.，et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expression in vivo.Mol.Ther.，2003.)，有助于解决上述问题。MC是一个环状表达盒子，不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA，可在体内长期表达高水平的转基因产物。在肝细胞内，HBV病毒基因组也能形成环状的DNA结构，称为共价键密闭环状DNA(cccDNA)。导致HBV感染治疗困难的关键，是cccDNA可在肝内存在多年，且对几乎所有药物不敏感。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与HBV cccDNA相同，使MC成为安全、高效的理想载体。

然而，MC也存在着投递到体内靶细胞效率不高的问题。

【发明内容】

基于此，有必要提供一种能够高效投递到靶细胞内的微环基因载体。

此外，还有必要提供一种上述微环基因载体的制备方法和应用。