[发明专利]利用大肠杆菌生产肿瘤转移抑制蛋白GDI2的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人肿瘤转移抑制蛋白GDI2在大肠杆菌中的表达与纯化的方法，尤其是涉及一种利用大肠杆菌高效制备高纯度天然肿瘤转移抑制蛋白GDI2的方法。

背景技术

Rho-GDP解离抑制因子2(Rho-GDP dissociation inhibitor 2，GDI2)，最早由Leffers等人发现，由201个氨基酸构成，是Rho GDP解离抑制因子(RhoGDI)家族的成员之一。近年来大量的研究证明RhoGDI2蛋白在人体中担负着阻止癌细胞在整个机体内扩散的任务，该蛋白能够非常有效的抑制肿瘤细胞的侵袭及转移，且内皮素1(ET-1)和神经介素U(NmU)可能为其作用靶点。GDI2在人体内经caspase-1酶切后21kDa的GDI2短肽通过失巢凋亡机制(Anoikis)能够大幅度增加癌细胞的凋亡，从而抑制了细胞的转移。作为一种具有良好应用前景的的抗癌药物蛋白，提高GDI2蛋白的工业化水平对于生产企业至关重要。

目前，在重组蛋白分离纯化方面，利用重组标签进行纯化的技术，是一种被广泛使用的方法。该方法利用标签与纯化柱中填料的特异亲和作用，从而实现蛋白的有效纯化，且获得的蛋白纯度较高，操作简单。但是该技术也有其瓶颈：纯化得到得到的目的蛋白仍然带有重组标签，所以需要利用外源蛋白酶来切除纯化标签，不仅增加了纯化过程的工作强度，延长了纯化时间，更重要的是外源蛋白酶价格昂贵，极大地增加了纯化成本。所以如何解决重组标签的切除问题，从而缩短纯化时间，降低工作强度，并降低纯化成本，对重组蛋白的工业化生产相当重要。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种解决当前利用重组标签进行蛋白纯化过程中出现的标签切除这个关键问题，而提供的一种操作简单、效率高的利用大肠杆菌生产肿瘤转移抑制蛋白GDI2的纯化方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

利用大肠杆菌生产肿瘤转移抑制蛋白GDI2的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将单个新鲜的大肠杆菌工程菌单克隆接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm/min的条件下振荡培养过夜，然后再将其接种于优化过的LB培养基中在相同条件下继续培养，当OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在37℃、200rpm/min的条件下继续培养6h；

(2)离心收集细胞，加入裂解液，超声破碎，收集上清液，利用Proinity eXect纯化柱对目的蛋白进行纯化，使用Band Buffer冲洗Proinity eXect纯化柱，再将上清液按2ml/min的速度上柱，接着使用Wash Buffer冲洗柱上杂蛋白，加入EloutionBuffrt孵育1h，最后收集穿透液，即获得纯化的肿瘤转移抑制蛋白GDI2，蛋白纯度可达到97％以上，蛋白回收率可达80％。

表达质粒为pPAL7-GDI2，其中含有编码人肿瘤转移抑制蛋白GDI2的基因序列与eXect纯化标签。

所述的LB培养基的组成包括以下组分及含量：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，利用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液将培养基的pH值调整至7.0，氨苄青霉素的含量为50μg/ml。

所述的优化过的LB培养基的组成包括以下组分及含量：蛋白胨10-15g/L、酵母粉5-10g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)2-5g/L、NaCl 1-2g/L、NaH₂PO₄·12H₂O 2-4g/L、Na₂HPO₄·3H₂O7-9g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4-6g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.2g/L、MgSO₄·7H₂O1-2g/L，溶剂为蒸馏水，利用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液将培养基的pH值调整至7.0。

所述的裂解液为0.1M PBS缓冲液，pH为7.2。

所述的Proinity eXect纯化柱为含有固定化枯草杆菌酶(subtilisin)填料的亲和层析柱。