[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征通用型实时荧光RT-PCR检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年在我国全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenicPRRS，HP-PRRS)。目前为止，PRRSV有两种型，欧洲型和美洲型，而美洲型又分为两种亚型，经典美洲株和高致病性美洲株，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的为美洲型毒株，欧洲株也偶有发现，因此在临床上需要一种能够快速诊断PRRSV的检测方法。

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)等，它们在病毒诊断与进出口检验检疫中发挥了重要作用，但各自在敏感性、特异性或时效性等方面存在不足。而荧光RT-PCR方法较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确，全封闭反应能有效解决PCR污染问题，且自动化程度高等特点。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的猪繁殖与呼吸综合征通用型荧光RT-PCR的检测方法对快速诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种猪繁殖与呼吸综合征通用型 的实时荧光RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为评价猪繁殖与呼吸综合征的感染情况提供了技术支持。

本发明是通过以下技术方案实现的：

中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供如下病毒：欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株；高致病性猪繁殖与呼吸综合征2006-2010年不同时期野毒株；其他猪源病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)。

猪繁殖与呼吸综合征特异性引物和探针设计：所述的特异性引物，指的是：长度为18～20个碱基左右的寡核苷酸链，与猪繁殖与呼吸综合征欧洲型和美洲型毒株的Nsp7基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；所述的特异性探针，指的是：长度为15个碱基的寡核苷酸链，其5’端标记FAM荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子，与猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的寡核苷酸引物对特征如下：由序列为ACTTCCAGATGCAGATTGTG及ACCTCCAGATGCCGTTTGTG的上游引物PRRSV-Eu-F22和PRRSV-Na-F22和序列为TCGTGCTGGGCGGCAAACG及TCGTGTTGGGTGGCAGAAA的下游引物PRRSV-Eu-R22和PRRSV-Na-R22组成；

用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针序列特征如下，该探针为PRRSV-P2，其序列为TACATTYTGGCCCCTGC(Y＝T/C)。

本发明还涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的寡核苷酸引物对和探针的组合物。

此外，还可将上述组合物制备成试剂盒。

进一步，本发明还涉及试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征中的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

一种利用上述寡核苷酸引物对和探针的组合物检测猪繁殖与呼吸综合征的实时荧光RT-PCR方法，包括：