[发明专利]在制备缀合疫苗中用于活化多糖的化学试剂

说明书

相关申请的参考

本申请要求申请日为2009年12月17日的、具有相同发明名称的美国临时申请No.61/287,593的优先权，其通过引用方式全文并入。

背景技术

1.发明领域

本申请涉及试剂以及将蛋白质与碳水化合物缀合的方法，特别是在生产疫苗过程中使用的方法和化学物质，以及由该方法生产的疫苗。

2.背景描述

已证实含有与碳水化合物共价连接的蛋白质的疫苗在诱导针对碳水化合物部分的免疫应答方面非常成功。此类疫苗的实例，即通常所述的“缀合物”，对于下列微生物是可获得的：b型流感嗜血菌(如，ActHib、Hiberix)，ACW和Y型脑膜炎奈瑟菌(如，Menactra)以及肺炎链球菌(如，Prevnar、Synflorix)。为了使蛋白质连接至碳水化合物上，后者通常需要被活化以使其能与蛋白质发生或直接或经由间隔物的反应(Dick，W.E.Jr and Beurret，M.Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens.A survey and consideration of design and preparation factors.刊载于：Conjugate Vaccines(Eds Cruse，J.M.and Lewis，R.E.)。Karger，Basel，1989.一种活化的方法是通过碳水化合物的氧化，以产生醛类，随后醛类通过还原氨化连接至蛋白质的赖氨酸上。在其它情况下，蛋白质首先由酰肼或氨氧基官能化，随后与碳水化合物上的醛反应(Lees，A.Use of amino-oxy functional groups in the preparation of protein-polysaccharide(PS)conjugate vaccines United States Patent Publication No.2005/0169941；通过引用方式并入)。另一种活化多糖的方法是使用溴化氰，以在多糖上形成氰-酯，其随后与间隔分子、例如己二酸二酰肼反应。然后官能化的多糖与蛋白质反应。改进的氰化多糖的方法是使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)(Lees，A.，Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents.美国专利号5,651,971；5,693,326；and 5,849,301)。CDAP可使蛋白质直接连接至多糖上。CDAP还可用于官能化具有间隔物的多糖，其随后连接到蛋白质上。酰肼或氨氧基官能化的蛋白质也可连接至CDAP活化的多糖上(美国专利号5,849,301；通过引用方式并入)。

发明概述

本发明克服了现有疫苗生产在策略和设计上的问题与不足，提供了蛋白质缀合的全新的工具与方法，尤其适用于疫苗生产。

本发明的一个实施方式涉及碳水化合物的缀合方法，其包括：将化合物，例如1-CBT或1-Cl或CPPT或2-CPO或其功能衍生物或修饰物与化合物混合以形成活化的化合物；和将活化的化合物与第二化合物混合以形成缀合物。优选所述化合物为天然或合成的碳水化合物、多糖、寡糖或它们的组合。同样优选所述第二化合物为肽、多肽或蛋白质，其可为抗原分子。缀合可以是直接的，也可以是通过另外的促进缀合的官能的间接缀合。所述过程优选进一步包括去除分子量小于缀合物的组分，其是通过例如透析、过滤、色谱或它们的组合。得到的缀合物优选为疫苗或诊断试剂。所述过程可进一步包括在活化的化合物和第二化合物之间引入连接化合物。所述过程的步骤以及连接物的引入优选同时进行，但也可各自独立进行。

本发明的另一实施方式涉及通过本发明的方法制备的疫苗。所述疫苗优选进一步包括药学上可接受的载体，其可包括但不仅限于水、盐水、乙醇、糖、多糖、油或它们的组合。

本发明的其他实施方式以及优势有一部分会在下面的发明详述中说明，有一部分可从发明详述是显而易见的，或可从本发明的实践中习得。

附图说明

图1.在Superdex200(1×30cm)凝胶过滤柱上运行的BSA/CDAP/葡聚糖和BSA/CPPT/葡聚糖的重叠色谱图。

图2.对使用1-CI官能化多糖的间接缀合的SEC HPLC分析。

图3.在Superdex200上得到的CRM(1-CI/Ps6A)缀合物色谱图。