[发明专利]一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及基因序列特定位点的检测，特别涉及一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法。

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子也就是脱氧核糖核酸序列产生了碱基对组成或者排列顺序的改变，包括碱基替换、缺失、插入、重复等。基因突变不仅仅是遗传病产生的原因，同时也是癌症发生、细菌病毒耐药性产生等的重要原因。而单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，也是基因突变在各物种的遗传累积。以SNP为主的遗传突变检测不仅仅对临床某些疾病的早期快速诊断，同时对于避免药物耐药性产生、指导合理用药、预警疾病发生具有重要的导向意义。

目前检测基因突变的方法有很多。金标准仍然是基因测序的方法，同时还有焦磷酸测序、核酸杂交、等位基因特异性扩增、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、多聚酶链限制性多态性长度分析(PCR-RFLP)、多聚酶链单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、反向斑点杂交法等许多针对已知或者位置的单核苷酸突变检测。虽然这些方法能够检测到基因突变，但是均面临的问题就是除引物、探针设计复杂外，同时需要具备昂贵的荧光检测用仪器，即使是金标准---基因测序的方法最直接有效，但周期过长。另外目前最容易推广的反向斑点杂交方法及延伸出来的技术一样面临杂交环境严格、准确率低、反应时间长、肉眼难以判读等问题。这些方法对于医疗系统和早期科研开发均难以普及应用。

基因芯片是近年出现的快速、高通量的检测工具，它是结合测序原理，通过在固相载体上固定具有针对性的核酸探针或蛋白质，对被检测组分进行杂交结合，最后引入发光信号(如荧光、生物素、放射性同位素)进行分析检测，从而达到样品分析的目的。但是，目前的核酸杂交芯片配备设备复杂、昂贵，同时假阴性、假阳性率也同时存在，尤其对于核酸分子的基因芯片，其质量控制更加难以掌握。

固相PCR技术是利用PCR原理，在固相载体上如毛细管、硅胶片、磁珠、玻璃片上等固定修饰的特异性引物进行PCR反应，其特点是反应简单，准确性高。但就实际操作而言，对于引物修饰及固定需要较为复杂的化学处理，如在硅胶片或毛细管上不仅需要对载体表面处理，同时需要对探针或引物进行修饰，以及同固相载体的配套的PCR仪器并不能推广应用，这样不仅使得制作程序复杂，同时引起实验重复性降低，导致常规固相PCR只能在实验室环境下完成科研工作。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，以检测基因序列特定位点的多态性，而且肉眼就可直接判断检测结果。

本发明是通过以下技术方案来实现：

1)针对目的基因的待测区域设计并合成PCR扩增引物对，在扩增引物的5`端增加生物素标记；提取包含目的基因的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以生物素标记的扩增引物对进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)针对目的基因待测区域的突变多态性，设计并合成多个长度为15～25nt的检测探针，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后；并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

3)对固相载体的表面进行修饰后，将检测探针和对照探针呈矩阵分布的固定在固相载体上，得到固定有检测探针和对照探针的检测阵列；

4)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于包含DNA聚合酶和反应底物的PCR反应液中，然后再加入检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；

5)固相核酸扩增完成后，取出检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用含亲和素-碱性磷酸酶的反应液覆盖检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH2O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH2O终止反应；

6)显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域相匹配，未显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域不相匹配；根据设计的检测探针及其阵列上的检测位点设计情况，对待测区域的突变多态性进行判读。

所述的以基因组DNA为模板的PCR扩增，扩增循环数为25～40，所扩增的片段长度不超过1000bp。

所述的检测探针包括多个针对检测突变多态性的位点，同一阵列上分布的探针的Tm值相差不超过2℃。