[发明专利]一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法

权利要求书

1.一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)针对目的基因的待测区域设计并合成PCR扩增引物对，在扩增引物的5`端增加生物素标记；提取包含目的基因的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以生物素标记的扩增引物对进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)针对目的基因待测区域的突变多态性，设计并合成多个长度为15～25nt的检测探针，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后；并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

3)对固相载体的表面进行修饰后，将检测探针和对照探针呈矩阵分布的固定在固相载体上，得到固定有检测探针和对照探针的检测阵列；

4)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于包含DNA聚合酶和反应底物的PCR反应液中，然后再加入检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；

5)固相核酸扩增完成后，取出检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用含亲和素-碱性磷酸酶的反应液覆盖检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH₂O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH₂O终止反应；

6)显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域相匹配，未显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域不相匹配；根据设计的检测探针及其阵列上的检测位点设计情况，对待测区域的突变多态性进行判读。

2.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的以基因组DNA为模板的PCR扩增，扩增循环数为25～40，所扩增的片段长度不超过1000bp。

3.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的检测探针包括多个针对检测突变多态性的位点，同一阵列上分布的探针的Tm值相差不超过2℃。

4.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在检测探针5`端进行polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6～15C序列的延长修饰；

所述的固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，检测探针5`端的辅助固定修饰为在检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

5.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜，将硝酸纤维素膜或尼龙膜在SSC溶液中浸泡30～60min后在35～40℃条件下干燥，然后再将检测探针和对照探针均匀喷涂在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经50～80℃干燥30～120min，紫外光照1～10min后，得到固定有检测探针和对照探针的硝酸纤维素或尼龙膜的检测阵列。

6.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记。

7.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的检测阵列在使用前还在体积浓度为2％～5％的BSA中37℃封闭至少15min。

8.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的变性处理为热变性处理：95℃以上至少放置5min，再在0℃至少放置3min；

或者，所述的变性处理为碱变性处理：将质量浓度10％的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1∶10～20的体积比混合，放置至少3min。

9.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的进行固相核酸扩增反应，其反应体系为40～200μl，包括变性处理后的PCR扩增产物，含DNA聚合酶、反应底物和Mg²⁺的PCR反应液，以及ddH₂O；加入的检测阵列浸没于反应体系内。

10.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，其特征在于，所述的固相核酸扩增反应完成后，取出检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；然后将检测阵列覆盖亲和素反应液后37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；取出检测阵列用ddH₂O冲洗，最后覆盖显色液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；

所述的洗脱液A的组成为100mmol/L pH＝7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl；洗脱液B的组成为100mmol/L pH＝9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl；

所述的亲和素反应液组成为1mL ddH₂O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为1mL显色缓冲液、6.5μlNBT合3.5μl BCIP。